Kryoviaalitkäytetään yleisesti solulinjojen ja muiden kriittisten biologisten materiaalien kryogeeniseen varastointiin nestemäisellä typellä täytetyissä dewareissa.

Solujen onnistuneeseen säilymiseen nestetypessä liittyy useita vaiheita. Vaikka perusperiaate on hidas jäädytys, tarkka käytetty tekniikka riippuu solutyypistä ja käytetystä kylmältä suojaavasta aineesta. On olemassa useita turvallisuusnäkökohtia ja parhaita käytäntöjä, jotka on otettava huomioon, kun kennoja säilytetään näin alhaisissa lämpötiloissa.

Tämän postauksen tarkoituksena on antaa yleiskatsaus siitä, kuinka kryovialeja säilytetään nestetypessä.

Mitä ovat kryoviaalit

Kryoviaalit ovat pieniä, korkkisia pulloja, jotka on suunniteltu nestemäisten näytteiden säilyttämiseen erittäin alhaisissa lämpötiloissa. Ne varmistavat, että kylmäsuoja-aineessa säilyneet solut eivät joudu suoraan kosketukseen nestemäisen typen kanssa, mikä minimoi solumurtumien riskin samalla kun hyötyvät nestemäisen typen äärimmäisestä viilentävästä vaikutuksesta.

Injektiopulloja on yleensä saatavana useissa eri tilavuuksissa ja -malleissa – ne voivat olla sisä- tai ulkokierteisiä tasaisella tai pyöristetyllä pohjalla. Saatavilla on myös steriilejä ja ei-steriilejä muotoja.

Kuka käyttääCyrovialssolujen varastointiin nestetypessä

Useat NHS:n ja yksityiset laboratoriot sekä napanuoraveripankkiin, epiteelisolubiologiaan, immunologiaan ja kantasolubiologiaan erikoistuneet tutkimuslaitokset käyttävät kryovialeita solujen kylmäsäilyttämiseen.

Tällä tavalla säilytettyihin soluihin kuuluvat B- ja T-solut, CHO-solut, hematopoieettiset kanta- ja esisolut, hybridoomat, suolistosolut, makrofagit, mesenkymaaliset kanta- ja esisolut, monosyytit, myelooma, NK-solut ja pluripotentit kantasolut.

Yleiskatsaus kryovialeiden säilyttämiseen nestetypessä

Kryosäilytys on prosessi, joka säilyttää solut ja muut biologiset rakenteet jäähdyttämällä ne erittäin alhaisiin lämpötiloihin. Soluja voidaan säilyttää nestetypessä vuosia ilman, että solujen elinkyky heikkenee. Tämä on yleiskatsaus käytetyistä menettelyistä.

Solun valmistelu

Tarkka menetelmä näytteiden valmistamiseksi vaihtelee solutyypistä riippuen, mutta yleensä solut kerätään ja sentrifugoidaan solurikkaan pelletin kehittämiseksi. Tämä pelletti suspendoidaan sitten uudelleen supernatanttiin, joka on sekoitettu kylmältä suojaavan aineen tai kylmäsäilytysväliaineen kanssa.

Kryosäilytysalusta

Tätä väliainetta käytetään solujen säilyttämiseen alhaisen lämpötilan ympäristöissä, joille ne altistuvat, estämällä solunsisäisten ja ekstrasellulaaristen kiteiden muodostumista ja siten solukuolemaa. Niiden tehtävänä on tarjota turvallinen, suojaava ympäristö soluille ja kudoksille pakastus-, varastointi- ja sulatusprosessien aikana.

Väliaine, kuten tuore jäädytetty plasma (FFP), heparinisoitu plasmalyyttiliuos tai seerumittomat, eläinkomponenttivapaat liuokset, sekoitetaan kylmältä suojaavien aineiden, kuten dimetyylisulfoksidin (DMSO) tai glyserolin kanssa.

Uudelleen nesteytetty näytepelletti jaetaan eriin polypropeenista kryovialeihin, kuten esimSuzhou Ace Biomedical Company Kryogeeniset säilytyspullot.

On tärkeää, että kryovialia ei täytetä liikaa, koska tämä lisää halkeiluriskiä ja sisällön mahdollista vapautumista (1).

Hallittu jäätymisnopeus

Yleensä hidasta kontrolloitua jäädytysnopeutta käytetään solujen onnistuneeseen kylmäsäilytykseen.

Kun näytteet on jaettu eriin kryogeenisiin pulloihin, ne asetetaan märän jään päälle tai 4 ℃:n jääkaappiin ja pakastusmenettely aloitetaan 5 minuutin kuluessa. Yleisohjeena on, että kennoja jäähdytetään nopeudella -1 - -3 minuutissa (2). Tämä saavutetaan ohjelmoitavalla jäähdyttimellä tai asettamalla injektiopullot eristettyyn laatikkoon, joka on sijoitettu -70 °C - -90 °C säädellyn nopeuden pakastimeen.

Siirto nestetyppeen

Jäädytetyt kryogeeniset pullot siirretään sitten nestemäisen typen säiliöön määräämättömäksi ajaksi edellyttäen, että lämpötila pidetään alle -135 ℃:ssa.

Nämä erittäin alhaiset lämpötilat voidaan saavuttaa upottamalla nestemäiseen tai höyryfaasiseen typpeen.

Neste- vai höyryfaasi?

Säilytyksen nestefaasissa typessä tiedetään ylläpitävän kylmää lämpötilaa ehdottoman yhtenäisenä, mutta sitä ei usein suositella seuraavista syistä:

• Tarve suurille määrille (syvyydelle) nestemäistä typpeä, joka on mahdollinen vaara. Tästä johtuvat palovammat tai tukehtuminen ovat todellinen riski.
• Dokumentoidut tapaukset, joissa tartunnanaiheuttajien, kuten aspergilluksen, hep B:n ja viruksen leviäminen nestemäisen typen välityksellä, on aiheuttanut ristikontaminaation (2,3)
• Nestemäisen typen mahdollisuus vuotaa injektiopulloihin upotuksen aikana. Kun typpi poistetaan varastosta ja lämmitetään huoneenlämpötilaan, se laajenee nopeasti. Tämän seurauksena injektiopullo voi särkyä, kun se poistetaan nestemäisen typen varastosta, mikä aiheuttaa vaaran sekä lentävistä roskista että altistumisesta sisällölle (1, 4).

Näistä syistä erittäin alhaisen lämpötilan varastointi tapahtuu useimmiten höyryfaasitypessä. Kun näytteitä on säilytettävä nestefaasissa, on käytettävä erityistä kryoflex-letkua.

Höyryfaasin haittapuoli on, että voi esiintyä pystysuoraa lämpötilagradienttia, mikä johtaa lämpötilan vaihteluihin välillä -135 ℃ ja -190 ℃. Tämä edellyttää nestemäisen typen tasojen ja lämpötilan vaihteluiden huolellista ja huolellista seurantaa (5).

Monet valmistajat suosittelevat, että kryoviaalit soveltuvat säilytykseen -135 ℃ asti tai käytettäväksi vain höyryfaasissa.

Kylmäsäilytettyjen solujen sulattaminen

Sulatusprosessi on stressaava jäädytetylle viljelmälle, ja asianmukaista käsittelyä ja tekniikkaa tarvitaan solujen optimaalisen elinkelpoisuuden, palautumisen ja toimivuuden varmistamiseksi. Tarkat sulatusprotokollat ​​riippuvat tietyistä solutyypeistä. Nopeaa sulatusta pidetään kuitenkin vakiona:

• Vähennä vaikutusta solujen palautumiseen
• Auta lyhentämään altistusaikaa pakastusväliaineessa oleville liuenneille aineille
• Minimoi jään uudelleenkiteytymisen aiheuttamat vahingot

Näytteiden sulattamiseen käytetään yleisesti vesihauteita, helmikylpyjä tai erityisiä automatisoituja laitteita.

Useimmiten 1 solulinja sulatetaan kerrallaan 1-2 minuutin ajan pyörittelemällä varovasti 37 ℃ vesihauteessa, kunnes injektiopullossa on vain pieni jääpala, ennen kuin ne pestään esilämmitetyssä kasvualustassa.

Joidenkin solujen, kuten nisäkäsalkioiden, hidas lämpeneminen on välttämätöntä niiden selviytymiselle.

Solut ovat nyt valmiita soluviljelyyn, solueristykseen tai hematopoieettisten kantasolujen tapauksessa elinkykytutkimuksiin luovuttajan kantasolujen eheyden takaamiseksi ennen myeloablatiivista hoitoa.

On normaali käytäntö ottaa pieniä eriä esipestystä näytteestä, jota käytetään solujen laskemiseen solukonsentraatioiden määrittämiseksi viljelmään maljalle. Tämän jälkeen voit arvioida solujen eristystoimenpiteiden tuloksia ja määrittää solujen elinkelpoisuuden.

Parhaat käytännöt kryoviaalien säilytykseen

Kryovialeihin tallennettujen näytteiden onnistunut kylmäsäilytys riippuu monista protokollan osista, mukaan lukien asianmukainen varastointi ja kirjaaminen.

• Jaa solut tallennuspaikkojen välillä– Jos tilavuudet sallivat, jaa solut injektiopulloihin ja säilytä ne eri paikoissa vähentääksesi näytteen katoamisen riskiä laitevioista.
• Estä ristikontaminaatio– Valitse kertakäyttöiset steriilit kryogeeniset injektiopullot tai autoklaavi ennen myöhempää käyttöä
• Käytä soluille sopivan kokoisia injektiopulloja– injektiopulloja on 1–5 ml:n tilavuuksina. Vältä injektiopullojen ylitäyttöä halkeamisvaaran vähentämiseksi.
• Valitse sisä- tai ulkokierteiset kryogeeniset injektiopullot– Jotkin yliopistot suosittelevat sisäkierteisiä injektiopulloja turvatoimiksi – ne voivat myös estää kontaminaation täytön aikana tai nestemäisessä typessä säilytettäessä.
• Estä vuoto- Käytä kahdesti ruiskutettuja tiivisteitä, jotka on valettu kierrekorkkiin tai O-renkaisiin vuotojen ja likaantumisen estämiseksi.
• Käytä 2D-viivakoodeja ja etikettipulloja– jäljitettävyyden varmistamiseksi injektiopullot, joissa on suuret kirjoitusalueet, mahdollistavat riittävän merkinnän. 2D-viivakoodit voivat auttaa tallennustilan hallinnassa ja tallenteiden säilyttämisessä. Värikoodatut korkit ovat hyödyllisiä helpottamaan tunnistamista.
• Riittävä säilytyshuolto- Jotta solut eivät katoa, säilytysastioiden tulee jatkuvasti seurata lämpötilaa ja nestemäisen typen tasoa. Hälyttimet tulee asentaa varoittamaan käyttäjiä virheistä.

Turvallisuusohjeet

Nestemäisestä typestä on tullut yleinen käytäntö nykyaikaisessa tutkimuksessa, mutta siihen liittyy vakavien vammojen riski, jos sitä käytetään väärin.

Asianmukaisia ​​henkilökohtaisia ​​suojavarusteita (PPE) tulee käyttää paleltumien, palovammojen ja muiden haitallisten tapahtumien riskin minimoimiseksi nestemäistä typpeä käsiteltäessä. Käyttää

• Kryogeeniset käsineet
• Laboratoriotakki
• Iskunkestävä kokokasvosuoja, joka peittää myös kaulan
• Suljetut kengät
• Roisketiivis muoviesiliina

Nestemäisen typen jääkaapit tulee sijoittaa hyvin tuuletettuihin tiloihin tukehtumisvaaran minimoimiseksi – ulos vapautunut typpi höyrystyy ja syrjäyttää ilmakehän hapen. Suurissa myymälöissä tulee olla alhaisen hapen hälytysjärjestelmät.

Parityöskentely nestemäistä typpeä käsiteltäessä on ihanteellista ja sen käyttö normaalin työajan ulkopuolella tulisi kieltää.

Kryoviaalit tukemaan työnkulkuasi

Suzhou Ace Biomedical -yritys tarjoaa laajan valikoiman tuotteita, jotka vastaavat erityyppisten solujen kylmäsäilytystarpeitasi. Valikoima sisältää valikoiman putkia sekä steriilejä kryovialeja.

Kryoviaalimme ovat:

• Laboratorion kierrekorkki 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryovialiset kryogeeniset injektiopullot kartiopohjainen kryoputki tiivisteellä

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml erittely, hameen kanssa tai ilman
  ● Saatavilla on kartiomainen tai itsestään seisova malli, steriili tai ei-steriili
  ● Kierrekorkkiputket on valmistettu lääketieteellisestä polypropeenista
  ● PP-kryoputkipulloja voidaan pakastaa ja sulattaa toistuvasti
  ●Ulkoinen korkin rakenne voi vähentää kontaminoitumisen todennäköisyyttä näytteen käsittelyn aikana.
  ● Kierrekorkki kryogeeniset putket Yleiskäyttöiset ruuvikierteet
  ● Putket sopivat yleisimpiin roottoreihin
  ● Kryogeeniset putken O-rengasputket sopivat tavallisiin 1- ja 2-tuumaisiin, 48-, 81-, 96- ja 100-kuoppaisiin pakastelaatikoihin.
  ● Autoklavoitavissa 121 °C:seen ja pakastettava -86 °C:seen

  OSA NRO	MATERIAALI	VOLUME	KORKKIVÄRI	PCS/LAUKKU	LAUKUT/KOTELO
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Musta, Keltainen, Sininen, Punainen, Purppura, Valkoinen	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Musta, Keltainen, Sininen, Punainen, Purppura, Valkoinen	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Musta, Keltainen, Sininen, Punainen, Purppura, Valkoinen	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Musta, Keltainen, Sininen, Punainen, Purppura, Valkoinen	500	10