Prosessien standardointiin kuuluu niiden optimointi ja myöhempi perustaminen ja harmonisointi, mikä mahdollistaa pitkän aikavälin optimaalisen suorituskyvyn – käyttäjästä riippumatta. Standardointi takaa korkealaatuiset tulokset sekä niiden toistettavuuden ja vertailukelpoisuuden.
(Klassisen) PCR:n tavoitteena on tuottaa luotettava ja toistettava tulos. Tietyissä sovelluksissa tuottoPCR-tuoteon myös relevanttia. Näissä reaktioissa on varmistettava, että näytteet eivät vaarannu ja että PCR-työnkulku pysyy vakaana. Tarkemmin sanottuna tämä tarkoittaa kontaminaatioiden minimoimista, mikä voisi johtaa vääriin positiivisiin tai vääriin negatiivisiin tuloksiin tai jopa estää PCR-reaktion. Lisäksi reaktio-olosuhteiden tulee olla mahdollisimman identtisiä kullekin yksittäiselle näytteelle ajon aikana ja myös siirrettävissä seuraaviin reaktioihin (samalla menetelmällä). Tämä viittaa reaktioiden koostumukseen sekä kiertolaitteen lämpötilan säätelyn tyyppiin. Käyttäjien virheitä tulee tietysti välttää niin paljon kuin mahdollista.
Alla esittelemme haasteita, joita kohdataan PCR:n valmistelun aikana ja koko ajon aikana – sekä lähestymistapoja ratkaisuihin, joita on olemassa PCR-työnkulkujen standardointiin käytettävien instrumenttien ja tarvikkeiden osalta.
Reaktion valmistelu
Reaktiokomponenttien annostelu PCR-astioihin tai levyihin, vastaavasti, sisältää useita haasteita, jotka on voitettava:
Reaktioolosuhteet
Yksittäisten komponenttien tarkka ja tarkka annostelu on välttämätöntä pyrittäessä mahdollisimman samanlaisiin reaktio-olosuhteisiin. Hyvän pipetointitekniikan lisäksi oikean työkalun valinta on tärkeää. PCR-perusseokset sisältävät usein aineita, jotka lisäävät viskositeettia tai muodostavat vaahtoa. Pipetointiprosessin aikana nämä johtavat materiaalin huomattavaan kastumiseenpipetin kärjet, mikä heikentää pipetoinnin tarkkuutta. Suoraannostelujärjestelmien tai vaihtoehtoisten pipetin kärkien käyttö, jotka ovat vähemmän alttiita kastumaan, voi parantaa pipetointiprosessin tarkkuutta ja tarkkuutta.
Epäpuhtaudet
Annosteluprosessin aikana muodostuu aerosoleja, jotka, jos niiden annetaan päästä pipetin sisäpuolelle, voivat mahdollisesti saastuttaa toisen näytteen seuraavan pipetointivaiheen aikana. Tämä voidaan estää käyttämällä suodatinkärkiä tai suoria syrjäytysjärjestelmiä.
Kulutustarvikkeet, kutenvinkkejä, astiat ja levyt, joita käytetään PCR-työnkulussa, eivät saa sisältää aineita, jotka vaarantavat näytettä tai vääristävät tulosta. Näitä ovat DNA, DNaasit, RNaasit ja PCR-estäjät sekä ainesosat, jotka voivat mahdollisesti huuhtoutua materiaalista reaktion aikana – aineita, jotka tunnetaan nimellä liukenevat aineet.
Käyttäjän virhe
Mitä enemmän näytteitä käsitellään, sitä suurempi on virheriski. Helposti voi käydä niin, että näyte pipetoidaan väärään astiaan tai väärään kuoppaan. Tätä riskiä voidaan merkittävästi vähentää kaivojen helposti havaittavilla merkinnöillä. Annosteluvaiheiden automatisoinnin avulla "inhimillinen tekijä" eli virheet ja käyttäjäkohtaiset vaihtelut minimoidaan, mikä lisää toistettavuutta erityisesti pienten reaktiotilavuuksien tapauksessa. Tämä edellyttää, että työpisteessä käytetään riittävän mittastabiileja levyjä. Liitetyt viivakoodit lisäävät koneellista luettavuutta, mikä yksinkertaistaa näytteiden seurantaa koko prosessin ajan.
Lämpöpyörän ohjelmointi
Laitteen ohjelmointi voi osoittautua aikaa vieväksi ja virhealttiiksi. Erilaiset PCR-lämpösyklilaitteen ominaisuudet toimivat yhdessä yksinkertaistaakseen tätä prosessivaihetta ja mikä tärkeintä, tehdäkseen siitä turvallisen:
Helppokäyttöisyys ja hyvä käyttöopastus ovat tehokkaan ohjelmoinnin perusta. Tälle perustalle rakentuva salasanasuojattu käyttäjien hallinta estää muiden käyttäjien muuttamasta omia ohjelmia. Jos käytössä on useita (saman tyyppisiä) pyörätimiä, on hyödyllistä, jos ohjelma voidaan siirtää suoraan soittimesta toiseen USB:n tai liitännän kautta. Tietokoneohjelmistot mahdollistavat ohjelmien, käyttöoikeuksien ja asiakirjojen keskitetyn ja turvallisen hallinnan tietokoneella.
PCR-ajo
Ajon aikana DNA monistetaan reaktioastiassa, jossa jokainen näyte tulee altistaa identtisille, yhdenmukaisille reaktio-olosuhteille. Seuraavat näkökohdat ovat tärkeitä prosessin kannalta:
Lämpötilan säätö
Erinomainen tarkkuus lämpötilan säätelyssä ja syklisointilohkon homogeenisuus ovat perusta kaikkien näytteiden tasaiselle lämpötilakäsittelylle. Lämmitys- ja jäähdytyselementtien (peltier-elementtien) korkea laatu sekä tapa, jolla ne on liitetty lohkoon, ovat ratkaisevia tekijöitä, jotka määräävät lämpötilaerojen riskin, joka tunnetaan nimellä "reunavaikutus".
Haihtuminen
Yksittäisten reaktiokomponenttien pitoisuudet eivät saa muuttua reaktion aikana haihtumisen vuoksi. Muuten on mahdollista, että hyvin vähänPCR-tuotevoidaan luoda tai ei ollenkaan. Siksi on erittäin tärkeää minimoida haihtuminen varmistamalla turvallinen tiivistys. Tässä tapauksessa lämpösyklilaitteen lämmitetty kansi ja astian tiiviste toimivat käsi kädessä. Saatavilla on erilaisia tiivistysvaihtoehtojaPCR-levyt (linkki: Tiivistysartikkeli), jolloin paras tiivistys saavutetaan kuumasaumauksella. Myös muut sulkimet voivat olla sopivia, kunhan pyörän kannen kosketuspainetta voidaan säätää valitun tiivisteen mukaan.
Prosessien standardointi on käytössä tarkkojen ja toistettavien tulosten turvaamiseksi pitkällä aikavälillä. Tämä sisältää laitteiden säännöllisen huollon sen varmistamiseksi, että ne ovat aina hyvässä toimintakunnossa. Kaikkien kulutustarvikkeiden tulee olla tasalaatuisia kaikissa tuotetuissa erissä, ja niiden luotettava saatavuus on taattava.
Postitusaika: 29.11.2022