Nukleiinihappouutto ja magneettinen helmimenetelmä

Esittely

Mikä on nukleiinihapon uutto?

Hyvin yksinkertaisimmin nukleiinihappouutto on RNA: n ja/tai DNA: n poistaminen näytteestä ja kaikki ylimäärä, joka ei ole välttämätöntä. Uuttamisprosessi eristää nukleiinihappot näytteestä ja tuottaa ne konsentroituneiden eluaattien muodossa, vapaa laimennusaineista ja epäpuhtauksista, jotka voivat vaikuttaa kaikkiin alavirran sovelluksiin.

Nukleiinihappouutto -sovellukset

Puhdistettuja nukleiinihappoja käytetään monissa eri sovelluksissa monilla eri aloilla. Terveydenhuolto on kenties alue, jolla sitä käytetään eniten, puhdistettu RNA ja DNA vaaditaan joukkoon erilaisia ​​erilaisia ​​testaustarkoituksia.

Nukleiinihappouution sovelluksia terveydenhuollossa ovat:

- PCR- ja QPCR -monistus

- Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS)

- Vahvistuspohjainen SNP-genotyyppi

- taulukkopohjainen genotyyppi

- Restriktioentsyymin sulaminen

- Analyysit käyttämällä entsyymejä (esim. Ligaatio ja kloonaus)

Terveydenhuollon ulkopuolella on myös muita aloja, joissa käytetään nukleiinihappouuttoa, mukaan lukien, mutta rajoittumatta isyystestaus, oikeuslääketiede ja genomiikka.

Lyhyt historia nukleiinihapon uuttoa

DNA: n uuttoPäivämäärä on pitkä matka, kun ensimmäinen tunnettu eristys on suorittanut sveitsiläinen lääkäri, nimeltään Friedrich Miescher vuonna 1869. Miescher toivoi ratkaisevansa elämän perusperiaatteet määrittämällä solujen kemiallinen koostumus. Lymfosyyttien epäonnistumisen jälkeen hän pystyi hankkimaan raa'an DNA: n saostumisen leukosyytteistä, joita löytyi mätänsä hylätyistä siteistä. Hän teki tämän lisäämällä happoa ja sitten alkalia soluun poistumaan solun sytoplasmasta ja kehitti sitten protokollan DNA: n erottamiseksi muista proteiineista.

Miescherin uraauurtavan tutkimuksen jälkeen monet muut tutkijat ovat edenneet ja kehittävät tekniikoita DNA: n eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Proteiinitieteilijä Edwin Joseph Cohn kehitti monia tekniikoita proteiinien puhdistamiseksi toisen maailmansodan aikana. Hän oli vastuussa veren plasman seerumin albumiinin fraktion eristämisestä, mikä on tärkeää verisuonten osmoottisen paineen ylläpitämisessä. Tämä oli ratkaisevan tärkeää pitää sotilaat elossa.

Vuonna 1953 Francis Crick määrittivät yhdessä Rosalind Franklinin ja James Watsonin kanssa DNA: n rakenteen osoittaen, että se koostui kahdesta nukleiinihappo -nukleotidiketjun säikeistä. Tämä läpimurto löytö tasoitti tietä Meselsonille ja Stahlille, jotka pystyivät kehittämään tiheysgradientin sentrifugointiprotokollan E. coli -bakteerien DNA: n eristämiseksi, kun ne osoittivat DNA: n puolikonservatiivisen replikaation 1958-kokeilun aikana.

Nukleiinihappouuttotekniikat

Mitkä ovat DNA: n uuttamisen 4 vaihetta?
Kaikki uuttomenetelmät nousevat samaan perustavanlaatuiseen vaiheeseen.

Solujen häiriöt. Tämä vaihe, joka tunnetaan myös nimellä solujen hajoaminen, sisältää soluseinämän ja/tai solukalvon hajottamisen, vapauttaakseen solunsisäiset nesteet, jotka sisältävät kiinnostavia nukleiinihappoja.

Ei -toivottujen roskien poistaminen. Tähän sisältyy kalvolipidit, proteiinit ja muut ei -toivotut nukleiinihappot, jotka voivat häiritä alavirran sovelluksia.

Eristäytyminen. On olemassa useita erilaisia ​​tapoja eristää kiinnostavat nukleiinihappot luomastasi puhdistetusta lysaatista, jotka kuuluvat kahden pääluokan välillä: liuospohjainen tai kiinteä tila (katso seuraava osa).

Keskittyminen. Kun nukleiinihapot on eristetty kaikista muista epäpuhtauksista ja laimeaineista, ne esitetään erittäin keskittyneessä eluaatissa.

Kaksi tyyppiä uuttoa
Nukleiinihapon uuttamista on kahta tyyppiä - liuospohjaiset menetelmät ja kiinteän tilan menetelmät. Liuospohjainen menetelmä tunnetaan myös nimellä kemiallinen uuttomenetelmä, koska siihen sisältyy kemikaalien käyttäminen solun hajottamiseen ja nukleisimateriaalin pääsyyn. Tämä voi käyttää joko orgaanisia yhdisteitä, kuten fenolia ja kloroformia, tai vähemmän haitallisia ja siten suositeltavia epäorgaanisia yhdisteitä, kuten proteinaasi K tai piidionegeeliä.

Esimerkkejä erilaisista kemiallisista uuttomenetelmistä solun hajottamiseksi ovat:

- Membraanin osmoottinen repeytyminen

- Soluseinämän entsymaattinen sulatus

- Kalvon liuottaminen

- Pesuaineiden kanssa

- alkalihoidolla

Kiinteän tilan tekniikat, jotka tunnetaan myös nimellä mekaaniset menetelmät, käsittävät hyödyntämisen, kuinka DNA on vuorovaikutuksessa kiinteän substraatin kanssa. Valitsemalla helmi tai molekyyli, johon DNA sitoutuu, mutta analyytti ei ole, on mahdollista erottaa nämä kaksi. Esimerkkejä kiinteän faasin uuttotekniikoista, mukaan lukien piidioksidi- ja magneettihelmien käyttö.

Magneettisen helmen uutto selitettiin

Magneettisen helmen uuttamismenetelmä
Magneettihelmien käyttämismahdollisuudet tunnustettiin ensin Trevor Hawkinsin tekemässä Yhdysvaltain patentissa Whitehead Institute Research Institution -yritykselle. Tämä patentti myönsi, että geneettisen materiaalin poiminta oli mahdollista sitomalla ne kiinteään tukikantajaan, mikä voi olla magneettinen helmi. Periaatteena on, että käytät erittäin funktionalisoitua magneettihelmiä, jolle geneettinen materiaali sitoutuu, joka voidaan sitten erottaa supernatantista levittämällä magneettinen voima näytettä pitävän aluksen ulkopuolelle.

Miksi käyttää magneettihelmien uuttamista?
Magneettisen helmen uuttamistekniikka on yhä yleisempi johtuen siitä potentiaalista, joka sillä on nopeat ja tehokkaat uuttamismenetelmät. Viime aikoina on tapahtunut erittäin funktionalisoitujen magneettihelmien kehitystä sopivilla puskurijärjestelmillä, jotka ovat mahdollistaneet nukleiinihapon uuttamisen ja työnkulun, joka on erittäin resurssivalo ja kustannustehokas. Myös magneettisten helmien uuttomenetelmät eivät sisällä sentrifugaatiovaiheita, jotka voivat aiheuttaa leikkausvoimia, jotka hajottavat pidemmät DNA -palat. Tämä tarkoittaa, että DNA: n pidemmät säikeet pysyvät ehjinä, mikä on tärkeää genomikokeissa.