Johdanto
Mikä on nukleiinihapon uuttaminen?
Yksinkertaisimmillaan nukleiinihappouutto tarkoittaa RNA:n ja/tai DNA:n poistamista näytteestä ja kaiken tarpeettoman ylimäärän poistamista. Uuttoprosessi eristää nukleiinihapot näytteestä ja tuottaa ne tiivistetyn eluaatin muodossa, jossa ei ole laimennusaineita ja kontaminantteja, jotka voisivat vaikuttaa myöhempään käyttöön.
Nukleiinihapon uuttamisen sovellukset
Puhdistettuja nukleiinihappoja käytetään lukuisissa erilaisissa sovelluksissa useilla eri teollisuudenaloilla. Terveydenhuolto on ehkä alue, jolla sitä käytetään eniten, sillä puhdistettua RNA:ta ja DNA:ta tarvitaan lukuisiin erilaisiin testaustarkoituksiin.
Nukleiinihapon uuttamisen sovelluksia terveydenhuollossa ovat:
- Next Generation Sequencing (NGS)
- Vahvistukseen perustuva SNP-genotyypitys
- Array-pohjainen genotyypitys
- Restriktioentsyymien pilkkominen
- Analyysit modifioivilla entsyymeillä (esim. ligaatio ja kloonaus)
Terveydenhuollon lisäksi on myös muita aloja, joilla käytetään nukleiinihappojen uuttamista, mukaan lukien isyystestaukset, oikeuslääketieteen ja genomiikka.
Nukleiinihapon uuttamisen lyhyt historia
DNA:n uuttaminenjuontaa juurensa pitkälle, ja ensimmäisen tunnetun eristyksen suoritti sveitsiläinen lääkäri nimeltä Friedrich Miescher vuonna 1869. Miescher toivoi ratkaisevansa elämän perusperiaatteet määrittämällä solujen kemiallisen koostumuksen. Epäonnistuttuaan lymfosyyttien kanssa hän pystyi saamaan raa'an DNA:n sakan leukosyyteistä, jotka löytyivät hylätyistä siteistä. Hän teki tämän lisäämällä happoa ja sitten alkalia soluun poistuakseen solun sytoplasmasta, ja kehitti sitten protokollan DNA:n erottamiseksi muista proteiineista.
Miescherin uraauurtavan tutkimuksen jälkeen monet muut tutkijat ovat edistyneet ja kehittäneet tekniikoita DNA:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Edwin Joseph Cohn, proteiinitutkija, kehitti monia tekniikoita proteiinien puhdistamiseen toisen maailmansodan aikana. Hän vastasi veriplasman seerumin albumiinifraktion eristämisestä, mikä on tärkeää verisuonten osmoottisen paineen ylläpitämisessä. Tämä oli ratkaisevan tärkeää sotilaiden hengissä pitämiselle.
Vuonna 1953 Francis Crick määritteli yhdessä Rosalind Franklinin ja James Watsonin kanssa DNA:n rakenteen ja osoitti, että se koostui kahdesta pitkistä nukleiinihapponukleotidiketjuista. Tämä läpimurtolöytö tasoitti tietä Meselsonille ja Stahlille, jotka pystyivät kehittämään tiheysgradienttisentrifugointiprotokollan DNA:n eristämiseksi E. coli -bakteereista, kun he osoittivat DNA:n puolikonservatiivisen replikaation vuoden 1958 kokeessaan.
Nukleiinihapon uuttamisen tekniikat
Mitkä ovat DNA:n erottamisen 4 vaihetta?
Kaikki uuttomenetelmät tiivistyvät samoihin perusvaiheisiin.
Solujen häiriö. Tämä vaihe, joka tunnetaan myös solujen hajoamisena, sisältää soluseinän ja/tai solukalvon hajoamisen kiinnostavia nukleiinihappoja sisältävien solunsisäisten nesteiden vapauttamiseksi.
Ei-toivottujen roskien poisto. Tämä sisältää kalvon lipidit, proteiinit ja muut ei-toivotut nukleiinihapot, jotka voivat häiritä myöhempiä sovelluksia.
Eristäytyminen. On olemassa useita erilaisia tapoja eristää kiinnostavat nukleiinihapot luomastasi kirkastetusta lysaatista, jotka jakautuvat kahteen pääluokkaan: liuospohjaiseen tai kiinteään olomuotoon (katso seuraava osa).
Keskittyminen. Kun nukleiinihapot on eristetty kaikista muista kontaminanteista ja laimentimista, ne esitetään erittäin väkevässä eluaatissa.
Kaksi uuttamistyyppiä
Nukleiinihappojen uuttamista on kahta tyyppiä – liuospohjaisia menetelmiä ja kiinteän olomuodon menetelmiä. Liuospohjainen menetelmä tunnetaan myös kemiallisena uuttomenetelmänä, koska se käsittää kemikaalien käytön solun hajottamiseksi ja nukleiinimateriaalin saamiseksi. Tämä voi olla joko orgaanisten yhdisteiden, kuten fenolin ja kloroformin, käyttöä tai vähemmän haitallisia ja siksi suositeltavia epäorgaanisia yhdisteitä, kuten Proteinase K tai silikageeli.
Esimerkkejä erilaisista kemiallisista uuttomenetelmistä solun hajottamiseksi ovat:
- Kalvon osmoottinen repeämä
- Soluseinän entsymaattinen pilkkominen
- Kalvon liukeneminen
- Pesuaineilla
- Alkalikäsittelyllä
Kiinteän olomuodon tekniikat, jotka tunnetaan myös mekaanisina menetelminä, sisältävät sen, kuinka DNA on vuorovaikutuksessa kiinteän substraatin kanssa. Valitsemalla helmi tai molekyyli, johon DNA sitoutuu, mutta analyytti ei, on mahdollista erottaa nämä kaksi. Esimerkkejä kiinteän faasin uuttotekniikoista, mukaan lukien piidioksidin ja magneettisten helmien käyttö.
Magneettisten helmien uuttaminen selitetty
Magneettisten helmien uuttomenetelmä
Mahdollisuus uuttamiseen magneettihelmillä tunnistettiin ensimmäisen kerran Yhdysvaltain patentissa, jonka Trevor Hawkins haki Whitehead Instituten tutkimuslaitokselle. Tässä patentissa tunnustettiin, että geneettistä materiaalia oli mahdollista erottaa sitomalla ne kiinteään kantaja-aineeseen, joka voisi olla magneettihelmi. Periaate on, että käytät erittäin funktionalisoitua magneettihelmeä, johon geneettinen materiaali sitoutuu, ja joka voidaan sitten erottaa supernatantista kohdistamalla magneettinen voima näytettä sisältävän astian ulkopuolelle.
Miksi käyttää magneettihelmien uuttamista?
Magneettihelmien uuttotekniikka on yleistymässä, koska siinä on potentiaalia nopeille ja tehokkaille uuttomenetelmille. Viime aikoina on kehitetty erittäin funktionalisoituja magneettihelmiä sopivilla puskurijärjestelmillä, jotka ovat mahdollistaneet nukleiinihappojen uuton automatisoinnin ja työnkulun, joka on erittäin resurssikeveä ja kustannustehokas. Magneettisten helmien uuttomenetelmät eivät myöskään sisällä sentrifugointivaiheita, jotka voivat aiheuttaa leikkausvoimia, jotka hajottavat pidempiä DNA-kappaleita. Tämä tarkoittaa, että pidemmät DNA-juosteet pysyvät ehjinä, mikä on tärkeää genomiikkatestauksessa.
Postitusaika: 25.11.2022