Vaikka teoriassa yksi templaatin molekyyli olisi riittävä, klassiseen PCR: ään käytetään tyypillisesti huomattavasti suurempia määriä DNA: ta, esimerkiksi jopa 1 ug genomista nisäkkäiden DNA: ta ja niin vähän kuin 1 pg plasmidi -DNA: ta. Optimaalinen määrä riippuu suurelta osin kohdesekvenssin kopioiden lukumäärästä sekä sen monimutkaisuudesta.
Jos käytetään hyvin vähän mallia, tarvitaan vastaava lisäys monistusjaksojen lukumäärässä riittävän määrän tuotteen saamiseksi. Taq-polymeraasissa, jota käytetään useimmissa PCR-kokeissa, ei ole korjausfunktiota (3'-5'-eksonukleaasiaktiivisuus); Siten vahvistuksen aikana tapahtuvia virheitä ei voida korjata. Mitä suurempi syklien lukumäärä, sitä yleisempi virheellisen tuotteen monistus on. Jos toisaalta templaatin määrä on liian korkea, alukkeiden hehkuttamisen todennäköisyys muihin (ei sataprosenttisesti ilmaiseen) sekvenssiin, samoin kuin alukkeiden dimeerien muodostuminen kasvaa, mikä johtaa monistumiseen sivutuotteet. Monissa tapauksissa DNA eristetään soluviljelmistä tai mikro -organismeista ja sitä käytetään myöhemmin PCR -templaattina. Puhdistuksen jälkeen on välttämätöntä määrittää DNA: n konsentraatio, jotta PCR -asetukseen tarvitaan tilavuus. Vaikka agaroosigeelielektroforeesi voi tarjota arvion, tämä menetelmä ei ole kaukana tarkasta. UV-Vis-spektrofotometria on määritetty kultastandardiksi nukleiinihappojen kvantifioinnille; Tämä suora ja helppo ja nopea menetelmä mittaa näytteen absorbanssia 260 nm: ssä, ja pitoisuus lasketaan muuntokertoimen avulla.
Jos DNA -konsentraatio on kuitenkin erittäin alhainen (<1 ug/ml dsDNA) tai jos se on saastunut aineilla, jotka myös absorboivat 260 nm: n alueella (esim. RNA, proteiini, suolat), tämä menetelmä saavuttaa rajoituksensa. Hyvin alhaisten pitoisuuksien tapauksessa lukemat ovat pian liian epätarkkoja, jotta ne voidaan käyttää, ja saastumiset johtavat (joskus valtavaan) todellisen arvon yliarviointiin. Tässä tapauksessa fluoresenssin kvantifiointi voi olla vaihtoehto. Tämä tekniikka perustuu fluoresoivan väriaineen käyttöön, joka sitoutuu spesifisesti dsDNA: hon vain kpleiinihappoa käsittelevä kompleksi ja väriaine herättää valon, ja se sitten säteilee valoa, jolla on hiukan korkeampi aallonpituus. Tässä fluoresoivan signaalin voimakkuus on verrannollinen DNA: n määrään, ja sen pitoisuuden määrittämiseksi se arvioidaan suhteessa standardikäyrään. Tämän menetelmän edut lepäävät sidoksen spesifisyyteen, joka sulkee pois saastumisen aiheuttamat ulkoiset vaikutukset, samoin kuin siitä, että se on havaittavissa erittäin alhaiset DNA -pitoisuudet. Kummankin menetelmän soveltuvuus riippuu pääasiassa näytteen pitoisuudesta ja puhtaudesta; Monissa tapauksissa voi olla jopa suositeltavaa soveltaa molemmat menetelmät rinnakkain.
Viestin aika: marraskuu-30-2022