گودالمعمولاً برای ذخیره کرایوژنیک رده های سلولی و سایر مواد بیولوژیکی مهم ، در شبنم پر از نیتروژن مایع استفاده می شود.

چندین مرحله در حفظ موفقیت آمیز سلول ها در نیتروژن مایع وجود دارد. در حالی که اصل اساسی یک یخ آهسته است ، تکنیک دقیق به کار رفته به نوع سلول و محافظت کننده مورد استفاده بستگی دارد. چندین ملاحظات ایمنی و بهترین روشها برای در نظر گرفتن سلولها در چنین دمای پایین وجود دارد.

این پست با هدف ارائه کلی در مورد چگونگی ذخیره کرایوویال ها در نیتروژن مایع ارائه شده است.

کرایووال ها چیست

Cryovials ویال های کوچک و پوشیده شده برای ذخیره نمونه های مایع در دماهای بسیار کم طراحی شده است. آنها اطمینان می دهند که سلولهای حفظ شده در محافظت کننده با نیتروژن مایع در تماس مستقیم قرار نمی گیرند و خطر شکستگی های سلولی را به حداقل می رسانند ، در حالی که هنوز از اثر خنک کننده شدید نیتروژن مایع بهره مند می شوند.

ویال ها معمولاً در طیف وسیعی از حجم ها و طرح ها در دسترس هستند - می توانند از نظر داخلی یا خارجی با کف های مسطح یا گرد پیچیده شوند. قالبهای استریل و غیر استریل نیز در دسترس هستند.

چه کسی استفاده می کندسرودبرای ذخیره سلول ها در نیتروژن مایع

طیف وسیعی از NHS و آزمایشگاه های خصوصی و همچنین موسسات تحقیقاتی که در زمینه بانکداری خون بند ناف ، زیست شناسی سلولهای اپیتلیال ، ایمونولوژی و زیست شناسی سلول های بنیادی از Cryovials برای سلولهای کریپرس استفاده می کنند.

سلولهای حفظ شده از این روش شامل سلولهای B و T ، سلولهای CHO ، سلولهای بنیادی خونساز و پیش سازنده ، هیبریدوما ، سلولهای روده ، ماکروفاژها ، ساقه مزانشیمی و سلولهای پیش ساز ، مونوسیتها ، میلوما ، سلولهای NK و سلولهای بنیادی پرتوان هستند.

نمای کلی از نحوه ذخیره کرایوویال ها در نیتروژن مایع

CryopReservation فرآیندی است که با خنک کردن آنها در دمای بسیار پایین ، سلول ها و سایر سازه های بیولوژیکی را حفظ می کند. سلولها می توانند سالها در نیتروژن مایع بدون از بین رفتن زنده ماندن سلول ذخیره شوند. این یک طرح کلی از رویه های به کار رفته است.

تهیه سلولی

روش دقیق برای تهیه نمونه ها بسته به نوع سلول متفاوت خواهد بود ، اما به طور کلی ، سلول ها جمع آوری و سانتریفیوژ می شوند تا یک گلوله غنی از سلول ایجاد شوند. این گلوله سپس در مایع رویی مخلوط شده با CryoProtectant یا یک محیط حفاظت از کریپسیو به حالت تعلیق در می آید.

مدیوم

این محیط برای حفظ سلولها در محیط های با دمای پایین که با مهار تشکیل بلورهای داخل و خارج سلولی و از این رو مرگ سلولی در معرض آن قرار می گیرند ، استفاده می شود. نقش آنها فراهم کردن یک محیط ایمن و محافظ برای سلول ها و بافت ها در طی فرآیندهای انجماد ، ذخیره و ذوب است.

رسانه ای مانند پلاسما یخ زده تازه (FFP) ، محلول پلاسمالیت هپارین شده یا محلول های عاری از سرم ، حیوانی با حیوانی با محافظت کننده هایی مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) یا گلیسرول مخلوط می شود.

گلوله نمونه مجدداً در کرایویال های پلی پروپیلن مانند مانندشرکت زیست پزشکی Suzhou Ace Vials ذخیره سازی Cryogenic.

این مهم است که بیش از حد کرایوویال ها را پر نکنید زیرا این امر باعث افزایش خطر ترک خوردگی و انتشار احتمالی محتویات می شود (1).

نرخ یخ کنترل شده

به طور کلی ، میزان یخبندان کنترل شده آهسته برای محافظت موفقیت آمیز سلول ها استفاده می شود.

بعد از اینکه نمونه ها در ویال های کرایوژنیک قرار می گیرند ، روی یخ های مرطوب یا در یخچال 4 ℃ قرار می گیرند و روش انجماد طی 5 دقیقه شروع می شود. به عنوان یک راهنمای کلی ، سلولها با سرعت -1 تا 3 در دقیقه خنک می شوند (2). این امر با استفاده از یک کولر قابل برنامه ریزی یا با قرار دادن ویال در یک جعبه عایق بندی شده در فریزر -70 درجه سانتیگراد تا -90 درجه سانتیگراد کنترل می شود.

انتقال به نیتروژن مایع

ویال های کرایوژنیک یخ زده سپس برای دوره های نامشخص به یک مخزن نیتروژن مایع منتقل می شوند و دمای کمتر از -135 را حفظ می کنند.

این دمای فوق العاده کم را می توان با غوطه وری در نیتروژن فاز مایع یا بخار بدست آورد.

فاز مایع یا بخار؟

ذخیره در نیتروژن فاز مایع برای حفظ دمای سرما با قوام مطلق شناخته شده است ، اما اغلب به دلایل زیر توصیه نمی شود:

• نیاز به حجم بزرگ (عمق) نیتروژن مایع که یک خطر بالقوه است. سوختگی یا آسفیكس به دلیل این خطر واقعی است.
• موارد مستند آلودگی متقاطع توسط عوامل عفونی مانند آسپرژیلوس ، HEP B و پخش ویروسی از طریق محیط نیتروژن مایع (2،3)
• پتانسیل نیتروژن مایع در هنگام غوطه وری به ویال ها نشت می کند. هنگامی که از انبار خارج شده و به دمای اتاق گرم می شود ، نیتروژن به سرعت گسترش می یابد. در نتیجه ، ویال ممکن است هنگام برداشتن از ذخیره نیتروژن مایع خرد شود و خطری را از بقایای پرواز و قرار گرفتن در معرض محتویات ایجاد کند (1 ، 4).

به همین دلایل ، ذخیره سازی دمای فوق العاده کم بیشتر در نیتروژن فاز بخار است. هنگامی که نمونه ها باید در فاز مایع ذخیره شوند ، باید از لوله های تخصصی Cryoflex استفاده شود.

روند نزولی فاز بخار این است که یک گرادیان درجه حرارت عمودی می تواند رخ دهد که منجر به نوسانات دما بین -135 ℃ و -190 ℃ شود. این امر نیاز به نظارت دقیق و کوشا بر سطح نیتروژن مایع و تغییرات دما دارد (5).

بسیاری از تولید کنندگان توصیه می کنند که Cryovials برای ذخیره سازی تا -135 ℃ یا فقط برای استفاده در فاز بخار مناسب است.

سلولهای کریپری شده خود را ذوب کنید

روش ذوب برای یک کشت یخ زده استرس زا است ، و برای اطمینان از زنده ماندن ، بازیابی و عملکرد سلول ها ، استفاده و تکنیک مناسب لازم است. پروتکل های ذوب دقیق به انواع خاص سلول بستگی دارد. با این حال ، ذوب سریع استاندارد در نظر گرفته می شود:

• هرگونه تأثیر در بازیابی سلولی را کاهش دهید
• به کاهش زمان قرار گرفتن در معرض املاح موجود در رسانه انجماد کمک کنید
• هرگونه آسیب در اثر مجدد یخبندان را به حداقل برسانید

حمام های آب ، حمام های مهره یا ابزارهای تخصصی خودکار معمولاً برای ذوب نمونه ها استفاده می شوند.

بیشتر اوقات 1 خط سلولی در یک زمان به مدت 1-2 دقیقه ذوب می شود ، با چرخاندن به آرامی در یک حمام آب 37 ℃ تا زمانی که فقط یخ کمی در ویال باقی بماند قبل از شستشو در یک محیط رشد پیش از خواب.

برای برخی از سلول ها مانند جنین پستانداران ، گرم شدن آهسته برای بقای آنها ضروری است.

سلولها اکنون برای کشت سلول ، جداسازی سلول یا در مورد سلولهای بنیادی خونریزی آماده شده اند - مطالعات زنده ماندن برای تضمین یکپارچگی سلولهای بنیادی اهدا کننده قبل از درمان میلوآبتیو.

این یک عمل طبیعی است که از نمونه های کوچک از نمونه از پیش شسته شده استفاده شده برای انجام تعداد سلول برای تعیین غلظت سلول برای آبکاری در کشت استفاده شود. سپس می توانید نتایج روشهای جداسازی سلولی را ارزیابی کرده و زنده ماندن سلول را تعیین کنید.

بهترین روشها برای ذخیره سازی کرایویالی

محافظت موفق از نمونه های ذخیره شده در Cryovials بستگی به بسیاری از عناصر موجود در پروتکل از جمله ذخیره سازی مناسب و نگهداری سوابق دارد.

• سلول ها را بین مکان های ذخیره سازی تقسیم کنید- اگر حجم اجازه می دهد ، سلولهای بین ویال ها را تقسیم کرده و آنها را در مکان های جداگانه ذخیره کنید تا خطر از بین رفتن نمونه به دلیل خرابی تجهیزات کاهش یابد.
• از آلودگی متقابل جلوگیری کنید-قبل از استفاده بعدی ، ویال های کرایوژنیک استریل یا اتوکلاو را انتخاب کنید
• از ویال های مناسب برای سلول های خود استفاده کنید- ویال ها در طیف وسیعی از حجم بین 1 تا 5 میلی لیتر قرار می گیرند. برای کاهش خطر ترک خوردگی ، از پر کردن بیش از حد ویال خودداری کنید.
• ویال های کرایوژنیک داخلی یا خارجی را انتخاب کنید- ویال های مورد نظر داخلی توسط برخی دانشگاه ها برای اقدامات ایمنی توصیه می شود - آنها همچنین می توانند از آلودگی در هنگام پر شدن یا هنگام ذخیره در نیتروژن مایع جلوگیری کنند.
• از نشت جلوگیری کنید-برای جلوگیری از نشت و آلودگی ، از مهر و موم های دو تزریق شده در داخل حلقه یا حلقه های O استفاده کنید.
• از بارکد 2D و ویال برچسب استفاده کنید- برای اطمینان از قابلیت ردیابی ، ویال هایی با مناطق بزرگ نوشتن ، هر ویال را قادر می سازد تا دارای برچسب کافی باشد. بارکد 2D می تواند به مدیریت ذخیره سازی و نگهداری ضبط کمک کند. کلاه های کدگذاری شده رنگ برای شناسایی آسانتر مفید هستند.
• نگهداری کافی از ذخیره سازی- برای اطمینان از از بین رفتن سلولها ، عروق ذخیره سازی باید به طور مداوم درجه حرارت و نیتروژن مایع را کنترل کنند. هشدارها باید برای هشدار دادن به کاربران از خطاها مناسب باشند.

اقدامات احتیاطی

نیتروژن مایع در تحقیقات مدرن به روش متداول تبدیل شده است اما در صورت استفاده نادرست ، خطر آسیب جدی را به همراه دارد.

تجهیزات محافظ شخصی مناسب (PPE) باید برای به حداقل رساندن خطر سرمازدگی ، سوختگی و سایر حوادث جانبی در هنگام کار با نیتروژن مایع به حداقل برسد. پوشیدن

• دستکش های کاردیوژنیک
• روکش آزمایشگاهی
• سپر کامل صورت مقاوم در برابر ضربه که گردن را نیز پوشش می دهد
• کفش های پا بسته
• پیش بند پلاستیکی ضد آب

یخچال و فریزرهای نیتروژن مایع باید در مناطق با تهویه مناسب قرار بگیرند تا خطر آسفکسی سازی به حداقل برسد-نیتروژن فرار می شود و اکسیژن جوی را جابجا می کند. فروشگاه های حجم زیاد باید دارای سیستم هشدار اکسیژن کم باشند.

کار به صورت جفت هنگام استفاده از نیتروژن مایع ایده آل است و استفاده از آن در خارج از ساعات کار عادی باید ممنوع باشد.

Cryovials برای پشتیبانی از گردش کار شما

شرکت زیست پزشکی Suzhou Ace طیف گسترده ای از محصولات را ارائه می دهد که نیازهای محافظت از شما برای انواع مختلف سلول را برآورده می کند. این نمونه کارها شامل طیف وسیعی از لوله ها و همچنین طیف وسیعی از کرایوال های استریل است.

Cryovials ما عبارتند از:

• CAP SCREW LAB 0.5ml 1.5ml 2.0ml cryovical Vials Cryotube مخروطی با واشر

  مشخصات 0.5 میلی لیتر ، 1.5 میلی لیتر ، 2.0 میلی لیتر ، با دامن یا بدون دامن
  ● طراحی مخروطی یا خود ایستاده ، استریل یا غیر استریل هر دو در دسترس هستند
  tube لوله های کلاه پیچ از پلی پروپیلن درجه پزشکی ساخته شده اند
  ● ویال های Cryotube PP می توانند به طور مکرر یخ زده و ذوب شوند
  ● طراحی درپوش خارجی می تواند احتمال آلودگی را در حین درمان نمونه کاهش دهد.
  tubes لوله های کرایوژنیک کلاه پیچ نخ پیچ جهانی برای استفاده
  ● لوله ها متناسب با روتورهای رایج هستند
  tube لوله های حلقه ای Cryogenic متناسب با استاندارد 1 اینچی و 2 اینچی ، 48well ، 81well ， 96well و 100 جعبه فریزر
  ● اتوکلاو تا 121 درجه سانتیگراد و تا -86 درجه سانتیگراد

  قسمت شماره	مادی	حجم	کلاهرنگ	رایانه های شخصی/کیسه	کیف/پرونده
  ACT05-bl-n	PP	0.5 میلی لیتر	سیاه ، زرد ، آبی ، قرمز ، بنفش ، سفید	500	10
  ACT15-bl-n	PP	1.5 میلی لیتر	سیاه ، زرد ، آبی ، قرمز ، بنفش ، سفید	500	10
  ACT15-bl-nw	PP	1.5 میلی لیتر	سیاه ، زرد ، آبی ، قرمز ، بنفش ، سفید	500	10
  ACT20-bl-n	PP	2.0 میلی لیتر	سیاه ، زرد ، آبی ، قرمز ، بنفش ، سفید	500	10