کرایویال هامعمولاً برای ذخیره سازی برودتی خطوط سلولی و سایر مواد حیاتی بیولوژیکی، در دوارهای پر از نیتروژن مایع استفاده می شود.

مراحل مختلفی در حفظ موفقیت آمیز سلول ها در نیتروژن مایع وجود دارد. در حالی که اصل اساسی انجماد آهسته است، روش دقیق به کار گرفته شده به نوع سلول و محافظ سرمای مورد استفاده بستگی دارد. چندین ملاحظات ایمنی و بهترین شیوه ها وجود دارد که باید در هنگام ذخیره سازی سلول ها در چنین دماهای پایینی در نظر گرفته شود.

هدف این پست ارائه یک نمای کلی از نحوه ذخیره کرایویال ها در نیتروژن مایع است.

کریوویال ها چیست؟

کرایویال ها ویال های کوچک و درپوش دار هستند که برای نگهداری نمونه های مایع در دمای بسیار پایین طراحی شده اند. آنها اطمینان حاصل می کنند که سلول های حفظ شده در انجماد در تماس مستقیم با نیتروژن مایع قرار نمی گیرند و خطر شکستگی سلولی را به حداقل می رساند و در عین حال از اثر خنک کنندگی شدید نیتروژن مایع بهره می برد.

ویال ها معمولا در طیف وسیعی از حجم ها و طرح ها موجود هستند - آنها می توانند به صورت داخلی یا خارجی با ته صاف یا گرد رزوه شوند. فرمت های استریل و غیر استریل نیز موجود است.

چه کسی استفاده می کندCyrovialsبرای نگهداری سلول ها در نیتروژن مایع

طیف وسیعی از NHS و آزمایشگاه‌های خصوصی، و همچنین موسسات تحقیقاتی متخصص در بانک خون بند ناف، زیست‌شناسی سلول‌های اپیتلیال، ایمونولوژی و زیست‌شناسی سلول‌های بنیادی از کرایویال‌ها برای حفظ انجماد سلول‌ها استفاده می‌کنند.

سلول های حفظ شده به این روش شامل سلول های B و T، سلول های CHO، سلول های بنیادی و پیش ساز خونساز، هیبریدوم ها، سلول های روده، ماکروفاژها، سلول های بنیادی و پیش ساز مزانشیمی، مونوسیت ها، میلوما، سلول های NK و سلول های بنیادی پرتوان هستند.

مروری بر نحوه نگهداری کریوویال ها در نیتروژن مایع

انجماد فرآیندی است که سلول ها و سایر ساختارهای بیولوژیکی را با سرد کردن آنها تا دمای بسیار پایین حفظ می کند. سلول ها را می توان سال ها در نیتروژن مایع بدون از دست دادن زنده ماندن سلول ذخیره کرد. این یک طرح کلی از رویه های به کار گرفته شده است.

آماده سازی سلول

روش دقیق آماده سازی نمونه ها بسته به نوع سلول متفاوت است، اما به طور کلی، سلول ها جمع آوری و سانتریفیوژ می شوند تا یک گلوله غنی از سلول ایجاد شود. سپس این گلوله در مایع رویی مخلوط با انجماد یا یک محیط انجماد معلق می شود.

محیط انجماد

این محیط برای حفظ سلول‌ها در محیط‌هایی با دمای پایین استفاده می‌شود که با مهار تشکیل کریستال‌های درون و برون سلولی و در نتیجه مرگ سلولی، در معرض آن قرار می‌گیرند. نقش آنها فراهم کردن یک محیط امن و محافظ برای سلول ها و بافت ها در طول فرآیندهای انجماد، ذخیره سازی و ذوب است.

محیطی مانند پلاسمای تازه منجمد (FFP)، محلول پلاسمالیت هپارینه شده یا محلول های بدون سرم و بدون اجزای حیوانی با محافظ های سرمایی مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) یا گلیسرول مخلوط می شود.

گلوله نمونه مجدد مایع شده به کریوویال های پلی پروپیلن مانندSuzhou Ace Biomedical شرکت Cryogenic Storage Vials.

مهم است که کرایویال ها را بیش از حد پر نکنید زیرا این امر خطر ترک خوردن و آزاد شدن محتویات را افزایش می دهد (1).

نرخ انجماد کنترل شده

به طور کلی، یک نرخ انجماد کنترل شده آهسته برای انجماد موفق سلول ها استفاده می شود.

پس از اینکه نمونه ها در ویال های برودتی تقسیم شدند، آنها را روی یخ مرطوب یا در یخچال 4 درجه سانتیگراد قرار داده و ظرف 5 دقیقه فرآیند انجماد آغاز می شود. به عنوان یک راهنمای کلی، سلول ها با سرعت -1 تا -3 در دقیقه خنک می شوند (2). این امر با استفاده از یک خنک کننده قابل برنامه ریزی یا با قرار دادن ویال ها در یک جعبه عایق که در فریزر با نرخ کنترل شده 70- تا 90- درجه سانتیگراد قرار داده می شود به دست می آید.

انتقال به نیتروژن مایع

سپس ویال‌های برودتی منجمد به یک مخزن نیتروژن مایع برای دوره‌های نامحدود منتقل می‌شوند، به شرط اینکه دمای کمتر از -135 درجه سانتیگراد حفظ شود.

این دماهای بسیار پایین را می توان با غوطه وری در نیتروژن فاز مایع یا بخار به دست آورد.

فاز مایع یا بخار؟

ذخیره سازی در نیتروژن فاز مایع برای حفظ دمای سرد با ثبات مطلق شناخته شده است، اما اغلب به دلایل زیر توصیه نمی شود:

• نیاز به حجم زیاد (عمق) نیتروژن مایع که یک خطر بالقوه است. سوختگی یا خفگی ناشی از این یک خطر واقعی است.
• موارد مستند از آلودگی متقاطع توسط عوامل عفونی مانند آسپرژیلوس، هپیت B و انتشار ویروسی از طریق محیط نیتروژن مایع (2،3)
• پتانسیل نشت نیتروژن مایع به داخل ویال ها در حین غوطه وری. هنگامی که از انبار خارج می شود و تا دمای اتاق گرم می شود، نیتروژن به سرعت منبسط می شود. در نتیجه، ویال ممکن است زمانی که از انبار نیتروژن مایع خارج شود، متلاشی شود و خطری هم از باقی مانده های پرنده و هم قرار گرفتن در معرض محتویات ایجاد کند (1، 4).

به این دلایل، ذخیره سازی در دمای بسیار پایین معمولاً در نیتروژن فاز بخار است. زمانی که نمونه ها باید در فاز مایع نگهداری شوند، باید از لوله های مخصوص کرایوفلکس استفاده شود.

نقطه ضعف فاز بخار این است که یک گرادیان دما عمودی می تواند رخ دهد که منجر به نوسانات دما بین -135 درجه سانتیگراد و -190 درجه می شود. این امر مستلزم نظارت دقیق و جدی سطوح نیتروژن مایع و تغییرات دما است (5).

بسیاری از تولیدکنندگان توصیه می‌کنند که کرایویال‌ها برای ذخیره‌سازی تا -135 درجه سانتیگراد یا فقط برای استفاده در فاز بخار مناسب هستند.

ذوب سلول های منجمد شده شما

روش ذوب برای یک کشت منجمد استرس زا است، و برای اطمینان از زنده ماندن، بازیابی و عملکرد بهینه سلول ها، روش و روش مناسب مورد نیاز است. پروتکل های ذوب دقیق به انواع سلول های خاص بستگی دارد. با این حال، ذوب سریع استاندارد در نظر گرفته می شود:

• کاهش هر گونه تأثیر بر ریکاوری سلولی
• به کاهش زمان قرار گرفتن در معرض املاح موجود در محیط انجماد کمک کنید
• هر گونه آسیب ناشی از تبلور مجدد یخ را به حداقل برسانید

معمولاً از حمام های آب، حمام های مهره ای یا ابزارهای خودکار تخصصی برای ذوب نمونه ها استفاده می شود.

اغلب 1 رده سلولی در یک زمان به مدت 1-2 دقیقه با چرخاندن آرام در یک حمام آب 37 درجه سانتیگراد ذوب می شود تا قبل از شستشو در یک محیط رشد از قبل گرم شده، فقط کمی یخ در ویال باقی بماند.

برای برخی از سلول ها مانند جنین پستانداران، گرم شدن آهسته برای بقای آنها ضروری است.

سلول‌ها اکنون آماده کشت سلولی، جداسازی سلولی، یا در مورد سلول‌های بنیادی خونساز - مطالعات زنده‌مانی برای تضمین یکپارچگی سلول‌های بنیادی دهنده قبل از درمان میلوآبلاتیو هستند.

برداشتن مقدار کمی از نمونه از پیش شسته شده برای انجام شمارش سلولی برای تعیین غلظت سلولی برای آبکاری در کشت معمولی است. سپس می‌توانید نتایج روش‌های جداسازی سلولی را ارزیابی کرده و زنده بودن سلول را تعیین کنید.

بهترین روش ها برای ذخیره سازی Cryovials

انجماد موفق نمونه های ذخیره شده در کرایویال ها به بسیاری از عناصر پروتکل از جمله ذخیره سازی مناسب و نگهداری سوابق بستگی دارد.

• سلول ها را بین مکان های ذخیره سازی تقسیم کنید- اگر حجم اجازه می دهد، سلول ها را بین ویال ها تقسیم کرده و در مکان های جداگانه ذخیره کنید تا خطر از دست رفتن نمونه به دلیل خرابی تجهیزات کاهش یابد.
• از آلودگی متقابل جلوگیری کنید– قبل از استفاده بعدی، ویال های کرایوژنیک استریل یکبار مصرف یا اتوکلاو را انتخاب کنید
• از ویال هایی با اندازه مناسب برای سلول های خود استفاده کنید– ویال ها در حجمی بین 1 تا 5 میلی لیتر هستند. برای کاهش خطر ترک خوردن ویال ها را بیش از حد پر نکنید.
• ویال های برودتی رزوه ای داخلی یا خارجی را انتخاب کنید- ویال‌های رزوه‌دار داخلی توسط برخی از دانشگاه‌ها برای اقدامات ایمنی توصیه می‌شوند - آنها همچنین می‌توانند از آلودگی در حین پر کردن یا زمانی که در نیتروژن مایع ذخیره می‌شوند جلوگیری کنند.
• جلوگیری از نشتی- برای جلوگیری از نشت و آلودگی از مهر و موم های دو تزریقی که در درپوش پیچ یا حلقه های O-رینگ قالب گیری شده اند استفاده کنید.
• از بارکدهای دو بعدی و ویال‌های برچسب استفاده کنید- برای اطمینان از قابلیت ردیابی، ویال‌هایی با نواحی نوشتاری بزرگ این امکان را می‌دهند که هر ویال به اندازه کافی برچسب‌گذاری شود. بارکدهای دو بعدی می توانند به مدیریت ذخیره سازی و نگهداری سوابق کمک کنند. کلاه های رنگی برای شناسایی راحت تر مفید هستند.
• نگهداری ذخیره سازی کافی- برای اطمینان از از بین نرفتن سلول ها، ظروف ذخیره سازی باید به طور مداوم دما و سطح نیتروژن مایع را کنترل کنند. هشدارها باید برای هشدار دادن به کاربران از خطا نصب شوند.

اقدامات احتیاطی ایمنی

نیتروژن مایع در تحقیقات مدرن رایج شده است اما در صورت استفاده نادرست خطر آسیب جدی را به همراه دارد.

تجهیزات حفاظت فردی مناسب (PPE) باید برای به حداقل رساندن خطر سرمازدگی، سوختگی و سایر حوادث نامطلوب هنگام کار با نیتروژن مایع استفاده شود. بپوشید

• دستکش برودتی
• روپوش آزمایشگاهی
• محافظ تمام صورت مقاوم در برابر ضربه که گردن را نیز می پوشاند
• کفش های پنجه بسته
• پیش بند پلاستیکی ضد پاشش

یخچال‌های نیتروژن مایع باید در مکان‌هایی با تهویه مناسب قرار داده شوند تا خطر خفگی به حداقل برسد – نیتروژن فراری تبخیر شده و اکسیژن اتمسفر را جابجا می‌کند. انبارهای بزرگ باید دارای سیستم هشدار اکسیژن کم باشند.

کار به صورت جفت هنگام کار با نیتروژن مایع ایده آل است و استفاده از آن در خارج از ساعات کاری عادی باید ممنوع شود.

Cryovials برای پشتیبانی از گردش کار شما

شرکت Suzhou Ace Biomedical طیف گسترده ای از محصولات را ارائه می دهد که نیازهای انجماد شما را برای انواع مختلف سلول ها برآورده می کند. این نمونه کارها شامل طیف وسیعی از لوله ها و همچنین طیف وسیعی از کریوویال های استریل است.

کرایویال های ما عبارتند از:

• درپوش پیچی آزمایشگاهی 0.5 میلی‌لیتر 1.5 میلی‌لیتر 2.0 میلی‌لیتر ویال‌های برودتی کرایوویال انجماد مخروطی پایینی با واشر

  ● مشخصات 0.5 میلی لیتر، 1.5 میلی لیتر، 2.0 میلی لیتر، با دامن یا بدون دامن
  ● طرح مخروطی یا خود ایستاده، استریل یا غیر استریل هر دو موجود هستند
  ● لوله های درپوش پیچ از پلی پروپیلن درجه پزشکی ساخته شده اند
  ● ویال های PP Cryotube را می توان به طور مکرر منجمد و ذوب کرد
  ● طراحی کلاهک خارجی می تواند احتمال آلودگی را در طول درمان نمونه کاهش دهد.
  ● لوله های برودتی درپوش پیچ رزوه های پیچ جهانی برای استفاده
  ● لوله ها برای اکثر روتورهای معمولی مناسب هستند
  ● لوله های اورینگ لوله برودتی مناسب جعبه های فریزر استاندارد 1 اینچی و 2 اینچی، 48 چاه، 81 چاه، 96 چاه و 100 چاه
  ● قابلیت اتوکلاو تا 121 درجه سانتی گراد و انجماد تا 86- درجه سانتی گراد

  قسمت شماره	مواد	VOLUME	CAPرنگ	PCS/کیسه	کیسه / کیف
  ACT05-BL-N	PP	0.5 میلی لیتر	مشکی، زرد، آبی، قرمز، بنفش، سفید	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5 میلی لیتر	مشکی، زرد، آبی، قرمز، بنفش، سفید	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5 میلی لیتر	مشکی، زرد، آبی، قرمز، بنفش، سفید	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0 میلی لیتر	مشکی، زرد، آبی، قرمز، بنفش، سفید	500	10