استخراج اسید نوکلئیک و روش مهره مغناطیسی

مقدمه

استخراج اسید نوکلئیک چیست؟

در ساده ترین عبارت، استخراج اسید نوکلئیک عبارت است از حذف RNA و/یا DNA از نمونه و تمام موارد اضافی که لازم نیست. فرآیند استخراج، اسیدهای نوکلئیک را از یک نمونه جدا می‌کند و آنها را به شکل یک محلول شستشوی غلیظ، عاری از رقیق‌کننده‌ها و آلاینده‌هایی که می‌تواند بر هر کاربرد پایین‌دستی تأثیر بگذارد، تولید می‌کند.

کاربردهای استخراج اسید نوکلئیک

اسیدهای نوکلئیک تصفیه شده در بسیاری از کاربردهای مختلف، در صنایع مختلف استفاده می شود. مراقبت‌های بهداشتی شاید منطقه‌ای باشد که بیشترین استفاده را در آن دارد، با RNA و DNA خالص‌شده برای اهداف مختلف آزمایشی مورد نیاز است.

کاربردهای استخراج اسید نوکلئیک در مراقبت های بهداشتی عبارتند از:

- تقویت PCR و qPCR

- توالی یابی نسل بعدی (NGS)

- ژنوتیپ SNP مبتنی بر تقویت

- ژنوتیپ مبتنی بر آرایه

- هضم آنزیم محدود

- تجزیه و تحلیل با استفاده از آنزیم های اصلاح کننده (مانند بستن و شبیه سازی)

همچنین زمینه‌های دیگری فراتر از مراقبت‌های بهداشتی وجود دارد که در آنها از استخراج اسید نوکلئیک استفاده می‌شود، از جمله آزمایش پدری، پزشکی قانونی و ژنومیک.

تاریخچه مختصری از استخراج اسید نوکلئیک

استخراج DNAقدمت بسیار طولانی دارد، اولین جداسازی شناخته شده توسط یک پزشک سوئیسی به نام فردریش میشر در سال 1869 انجام شد. میشر امیدوار بود که اصول اساسی زندگی را با تعیین ترکیب شیمیایی سلول ها حل کند. پس از شکست در لنفوسیت ها، او توانست رسوب خام DNA را از لکوسیت های موجود در چرک روی باندهای دور ریخته شده به دست آورد. او این کار را با افزودن اسید و سپس قلیایی به سلول انجام داد تا از سیتوپلاسم سلول خارج شود و سپس پروتکلی برای جداسازی DNA از سایر پروتئین ها ایجاد کرد.

به دنبال تحقیقات پیشگامانه Miescher، بسیاری از دانشمندان دیگر به پیشرفت و توسعه تکنیک هایی برای جداسازی و خالص سازی DNA پرداخته اند. ادوین جوزف کوهن، دانشمند پروتئین، تکنیک های بسیاری را برای خالص سازی پروتئین در طول جنگ جهانی دوم ابداع کرد. او مسئول جداسازی کسر آلبومین سرم پلاسمای خون بود که در حفظ فشار اسمزی در رگ‌های خونی مهم است. این برای زنده نگه داشتن سربازان بسیار مهم بود.

در سال 1953 فرانسیس کریک به همراه روزالیند فرانکلین و جیمز واتسون ساختار DNA را تعیین کردند و نشان دادند که از دو رشته زنجیره بلند نوکلئوتیدهای اسید نوکلئیک تشکیل شده است. این کشف مهم راه را برای Meselson و Stahl هموار کرد که توانستند یک پروتکل سانتریفیوژ با گرادیان چگالی را برای جداسازی DNA از باکتری E. Coli ایجاد کنند، همانطور که آنها همانندسازی نیمه محافظه کارانه DNA را در آزمایش 1958 خود نشان دادند.

تکنیک های استخراج اسید نوکلئیک

4 مرحله استخراج DNA چیست؟
همه روش های استخراج به مراحل اساسی یکسان خلاصه می شوند.

اختلال سلولی. این مرحله که به عنوان لیز سلولی نیز شناخته می شود، شامل شکستن دیواره سلولی و/یا غشای سلولی به منظور آزادسازی مایعات درون سلولی حاوی اسیدهای نوکلئیک مورد نظر است.

حذف زباله های ناخواسته. این شامل لیپیدهای غشایی، پروتئین ها و سایر اسیدهای نوکلئیک ناخواسته است که می توانند با کاربردهای پایین دست تداخل داشته باشند.

انزوا روش‌های مختلفی برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک مورد نظر از لیزات پاکسازی شده‌ای که ایجاد کرده‌اید وجود دارد که بین دو دسته اصلی قرار می‌گیرند: محلول پایه یا حالت جامد (به بخش بعدی مراجعه کنید).

تمرکز. پس از جداسازی اسیدهای نوکلئیک از سایر آلاینده‌ها و رقیق‌کننده‌ها، آنها در یک محلول با غلظت بالا ارائه می‌شوند.

دو نوع استخراج
دو نوع استخراج اسید نوکلئیک وجود دارد - روش های مبتنی بر محلول و روش های حالت جامد. روش مبتنی بر محلول به عنوان روش استخراج شیمیایی نیز شناخته می شود، زیرا شامل استفاده از مواد شیمیایی برای تجزیه سلول و دسترسی به مواد نوکلئیک است. این می تواند استفاده از ترکیبات آلی مانند فنل و کلروفرم یا ترکیبات معدنی کمتر مضر و توصیه شده مانند پروتئیناز K یا سیلیکاژل باشد.

نمونه هایی از روش های مختلف استخراج شیمیایی برای تجزیه یک سلول عبارتند از:

- پارگی اسمزی غشاء

- هضم آنزیمی دیواره سلولی

- حل شدن غشا

- با مواد شوینده

- با درمان قلیایی

تکنیک‌های حالت جامد، که به عنوان روش‌های مکانیکی نیز شناخته می‌شوند، شامل بهره‌برداری از نحوه تعامل DNA با یک بستر جامد است. با انتخاب مهره یا مولکولی که DNA به آن متصل می شود اما آنالیت نه، می توان این دو را از هم جدا کرد. نمونه هایی از تکنیک های استخراج فاز جامد از جمله استفاده از سیلیس و مهره های مغناطیسی.

استخراج مهره مغناطیسی توضیح داده شده است

روش استخراج مهره مغناطیسی
پتانسیل استخراج با استفاده از مهره های مغناطیسی برای اولین بار در یک حق اختراع ایالات متحده ثبت شده توسط ترور هاوکینز برای موسسه تحقیقاتی موسسه Whitehead شناسایی شد. این حق اختراع اذعان داشت که استخراج مواد ژنتیکی با اتصال آنها به یک حامل جامد که می تواند یک مهره مغناطیسی باشد، امکان پذیر است. اصل این است که شما از یک مهره مغناطیسی بسیار کاربردی استفاده می‌کنید که ماده ژنتیکی به آن متصل می‌شود و سپس می‌توان آن را با اعمال نیروی مغناطیسی به بیرون ظرف نگهدارنده نمونه از مایع رویی جدا کرد.

چرا از استخراج مهره مغناطیسی استفاده کنیم؟
تکنولوژی استخراج مهره های مغناطیسی به دلیل پتانسیلی که برای روش های استخراج سریع و کارآمد دارد، به طور فزاینده ای رایج می شود. در زمان‌های اخیر پیشرفت‌هایی در زمینه دانه‌های مغناطیسی بسیار کاربردی با سیستم‌های بافر مناسب صورت گرفته است که اتوماسیون استخراج اسید نوکلئیک و جریان کاری را که منابع بسیار سبک و مقرون به صرفه است ممکن ساخته است. همچنین، روش‌های استخراج مهره‌های مغناطیسی شامل مراحل سانتریفیوژ نمی‌شود که می‌تواند باعث ایجاد نیروهای برشی شود که قطعات طولانی‌تری از DNA را می‌شکند. این بدان معنی است که رشته های طولانی تر DNA دست نخورده باقی می مانند که در آزمایش ژنومیک مهم است.