Kriobialakzelula-lerroak eta beste material biologiko kritiko batzuk biltegiratzeko erabiltzen dira normalean, nitrogeno likidoz betetako dewaretan.

Nitrogeno likidoan zelulak arrakastaz kontserbatzeko hainbat fase daude. Oinarrizko printzipioa izozte motela den arren, erabiltzen den teknika zehatza erabiltzen den zelula motaren eta krioprotektorearen araberakoa da. Gelak tenperatura baxuetan gordetzean hainbat segurtasun-gogoeta eta praktika onak daude kontuan.

Argitalpen honek kriobialak nitrogeno likidoan nola gordetzen diren ikusi nahi du.

Zer dira kriobialak

Kriobialak lagin likidoak oso tenperatura baxuetan gordetzeko diseinatutako ontzi txikiak dira. Kriobabeslean gordetako zelulak nitrogeno likidoarekin zuzeneko kontaktua ez izatea ziurtatzen dute, haustura zelularrak izateko arriskua gutxituz, nitrogeno likidoaren muturreko hozte-efektuari etekina ateratzen dioten bitartean.

Bialak bolumen eta diseinu ugaritan daude eskuragarri; barrutik edo kanpotik hariztatu daitezke hondo lau edo biribilduekin. Formatu antzuak eta ez-antzuak ere eskuragarri daude.

Nork erabiltzen duZirobialakzelulak nitrogeno likidoan gordetzeko

NHS eta laborategi pribatu ugarik, baita korde-odolaren bankuan, zelula epitelialen biologian, immunologian eta zelula amaren biologian espezializatutako ikerketa-erakundeek kriobiolak erabiltzen dituzte zelulak kriokontserbatzeko.

Modu honetan kontserbatzen diren zelulen artean daude B eta T zelulak, CHO zelulak, zelula ama hematopoietikoak eta arbasoak, hibridomak, hesteetako zelulak, makrofagoak, zelula ama mesenkimalak eta arbasoak, monozitoak, mieloma, NK zelulak eta zelula ama anibadunak.

Nitrogeno likidoan kriobialak nola gordetzeko ikuspegi orokorra

Kriokontserbazioa zelulak eta beste eraikuntza biologiko batzuk kontserbatzen dituen prozesu bat da, oso tenperatura baxuetara hoztuz. Zelulak nitrogeno likidoan gorde daitezke urtetan zelulen bideragarritasuna galdu gabe. Hau da erabilitako prozeduren eskema.

Zelulen Prestaketa

Laginak prestatzeko metodo zehatza aldatu egingo da zelula motaren arabera, baina, oro har, zelulak bildu eta zentrifugatzen dira zeluletan aberatsa den pellet bat garatzeko. Ondoren, pellet hori berriro esekitzen da kriobabeslearekin edo kriokontserbazio-euskarri batekin nahastuta dagoen gainditzailean.

Kriokontserbazio euskarria

Euskarri hau jasango dituzten tenperatura baxuko inguruneetan zelulak kontserbatzeko erabiltzen da, zelulen barneko eta kanpoko kristalen sorrera eragotziz eta, ondorioz, zelulen heriotza. Haien eginkizuna izozte, biltegiratze eta desizozketa prozesuetan zelula eta ehunentzako ingurune seguru eta babesgarria eskaintzea da.

Plasma izoztu freskoa (FFP), plasmalito heparinizatutako disoluzioa edo serumik gabeko, animalia osagairik gabeko soluzio bat bezalako medio bat nahasten da krioprotektoreekin, hala nola dimetilsulfoxidoa (DMSO) edo glizerola.

Berriro likidatutako lagin-pelletak polipropilenozko kriobialetan zatitzen diraSuzhou Ace Biomedical konpainia Criogenic Storage Vials.

Garrantzitsua da kriobialak gehiegi ez betetzea, horrek pitzatzeko arriskua areagotuko baitu eta edukiak askatzeko (1).

Izozte-tasa kontrolatua

Oro har, izozte-abiadura kontrolatua motela erabiltzen da zelulak kriokontserbatzeko.

Laginak ontzi kriogenikoetan zatitu ondoren, izotz hezean edo 4 ℃ hozkailuan jartzen dira eta izozteko prozedura 5 minuturen buruan hasten da. Gida orokor gisa, zelulak -1 eta -3 minutuko abiaduran hozten dira (2). Hori hozkailu programagarri bat erabiliz edo -70°C-tik –90°C-ko tasa kontrolatuko izozkailu batean kokatutako kaxa isolatu batean bidoiak jarriz lortzen da.

Transferitu Nitrogeno likidora

Ondoren izoztutako ontzi kriogenikoak nitrogeno likidoko depositu batera transferitzen dira epe mugagabeetan, baldin eta -135 ℃ baino gutxiagoko tenperatura mantentzen bada.

Tenperatura ultra baxu hauek nitrogeno fase likidoan edo lurrunean murgilduta lor daitezke.

Likidoa ala Lurrun Fasea?

Fase likidoko nitrogenoan biltegiratzea tenperatura hotza koherentzia absolutuarekin mantentzen duela jakin da, baina askotan ez da gomendagarria arrazoi hauengatik:

• Arrisku potentziala den nitrogeno likido bolumen handien (sakonera) beharra. Erredurak edo asfixia hori dela eta benetako arriskua da.
• Agente infekziosoek, hala nola, aspergillus, hep B eta birusak nitrogeno likidoaren bidez hedatutako kutsadura gurutzatuaren kasuak (2,3)
• Murgiltzean nitrogeno likidoa ontzietara isurtzeko aukera. Biltegiratzetik kendu eta giro-tenperaturan berotzen denean, nitrogenoa azkar hedatzen da. Ondorioz, potoa hautsi egin daiteke nitrogeno likidotik biltegiratzetik kentzean, arriskua sortuz bai hondakin hegalariak bai edukiarekiko esposizioagatik (1, 4).

Arrazoi horiengatik, tenperatura ultra baxuko biltegiratzea lurrun faseko nitrogenoan izaten da. Laginak fase likidoan gorde behar direnean, hodi cryoflex espezializatuak erabili behar dira.

Lurrun-fasearen alde txarra da tenperatura-gradiente bertikala gerta daitekeela, eta ondorioz, -135 ℃ eta -190 ℃ arteko tenperatura gorabeherak izan daitezke. Honek nitrogeno likidoaren mailak eta tenperatura-aldaketak arretaz eta arduratsuan kontrolatu behar ditu (5).

Fabrikatzaile askok gomendatzen dute kriobial egokiak -135 ℃-raino biltegiratzeko edo lurrun fasean soilik erabiltzeko.

Desizoztu zure kriopreservatutako zelulak

Desizozte prozedura estresagarria da izoztutako kulturarentzat, eta manipulazio eta teknika egokiak behar dira zelulen bideragarritasun, berreskuratze eta funtzionaltasun optimoa bermatzeko. Desizozteko protokolo zehatzak zelula mota espezifikoen araberakoak izango dira. Hala ere, desizozketa azkarra estandartzat hartzen da:

• Murriztu edozein eragin zelulen berreskurapenean
• Izozteko medioetan dauden solutuen esposizio-denbora murrizten lagundu
• Izotzaren birkristalizazioaren ondoriozko kalteak gutxitzea

Ur-bainuak, ale-bainuak edo tresna automatizatu espezializatuak erabili ohi dira laginak desizozteko.

Gehienetan, zelula-lerro bat desizozten da aldi berean 1-2 minutuz, 37 ℃-ko ur-bainuan astiro-astiro birrinduz ontzian izotz pixka bat geratzen den arte, aurrez berotutako hazkuntza-erdian garbitu aurretik.

Zenbait zelularentzat, esate baterako, ugaztun enbrioiak, berotze motela ezinbestekoa da haien bizirauteko.

Orain zelulak prest daude zelula-hazkuntzarako, zelulak isolatzeko, edo zelula ama hematopoietikoen kasuan; bideragarritasun-azterketak, emaileen zelula amaren osotasuna bermatzeko terapia mieloablatiboa baino lehen.

Praktika normala da zelulen zenbaketa egiteko erabilitako aurrez garbitutako laginaren alikuota txikiak hartzea, zelulen kontzentrazioa zehazteko, kultiboetan plateratzeko. Ondoren, zelulak isolatzeko prozeduren emaitzak ebaluatu eta zelulen bideragarritasuna zehaztu dezakezu.

Kriobialak biltegiratzeko praktika onak

Kriobialetan gordetako laginen kriokontserbazio arrakastatsua protokoloko elementu askoren araberakoa da, besteak beste, biltegiratze egokia eta erregistroak gordetzea.

• Zatitu gelaxkak biltegiratze-kokapenen artean– Bolumenek ahalbidetzen badute, zatitu zelulak bideen artean eta gorde itzazu leku bereizietan, ekipoen hutsegiteen ondorioz laginak galtzeko arriskua murrizteko.
• Saihestu kutsadura gurutzatua– Aukeratu erabilera bakarreko bidoi kriogeniko esterilak edo autoklabea ondorengo erabili aurretik
• Erabili tamaina egokian zure zeluletarako- ontziek 1 eta 5 ml bitarteko bolumen sorta dute. Saihestu bidoiak gehiegi betetzea pitzatzeko arriskua murrizteko.
• Aukeratu barruko edo kanpotik hariztutako ontzi kriogenikoak– Barruan hariztutako bidoiak gomendatzen dituzte unibertsitate batzuek segurtasun neurrietarako; gainera, kutsadura saihestu dezakete betetzean edo nitrogeno likidoan gordetzen direnean.
• Saihestu ihesak- Erabili torloju-kapean edo O-eraztunetan moldatutako bi injektatutako zigiluak, ihesak eta kutsadura saihesteko.
• Erabili 2D barra-kodeak eta etiketa-bidoiak– Trazabilitatea bermatzeko, idazketa-eremu handiak dituzten ontziek ontzi bakoitza behar bezala etiketatzea ahalbidetzen dute. 2D barra-kodeek biltegiratzea kudeatzen eta erregistroak gordetzen lagun dezakete. Kolore kodetutako txapelak erabilgarriak dira errazago identifikatzeko.
• Biltegiratzeko mantentze-lan egokia- Zelulak gal ez daitezen, biltegiratze-ontziek tenperatura eta nitrogeno likidoaren maila etengabe kontrolatu behar dituzte. Alarmak jarri behar dira erabiltzaileei akatsen berri emateko.

Segurtasun-neurriak

Nitrogeno likidoa ohikoa bihurtu da ikerketa modernoetan, baina gaizki erabiltzen badira lesio larriak izateko arriskua du.

Nitrogeno likidoa manipulatzean izozteak, erredurak eta bestelako gertakari kaltegarriak izateko arriskua minimizatzeko norberaren babeserako ekipamendu (PPE) egokiak erabili behar dira. Jantzi

• Eskularru kriogenikoak
• Laborategiko bata
• Inpaktuarekiko erresistentea den aurpegi osoa lepoa ere estaltzen duena
• Oinetakoak itxita
• Plastikozko amantala zipriztinduta

Nitrogeno likidoko hozkailuak ondo aireztatutako guneetan jarri behar dira asfixia-arriskua minimizatzeko; ihes egiten duen nitrogenoa lurrundu eta oxigeno atmosferikoa desplazatzen du. Bolumen handiko biltegiek oxigeno gutxiko alarma sistemak izan behar dituzte.

Nitrogeno likidoa manipulatzean binaka lan egitea aproposa da eta ohiko lanaldietatik kanpo erabiltzea debekatu egin behar da.

Kriobialak zure lan-fluxua laguntzeko

Suzhou Ace Biomedical konpainiak zelula mota desberdinetarako kriokontserbazio beharrak asetzen dituzten produktuen aukera zabala eskaintzen du. Karterak hodi sorta bat biltzen du, baita kriobial esteril sorta bat ere.

Gure kriobialak hauek dira:

• Laborategiko Torlojuzko Tapoia 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Kriobial Kriogeniko Bialak Hondo Konikoa Hondo Kriohodiarekin Juntarekin

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml zehaztapena, gona edo gona gabe
  ● Diseinu konikoa edo zutik dagoena, antzua edo ez-antzua eskuragarri dago
  ● Torlojuzko tapoiaren hodiak mediku-mailako polipropilenoz eginda daude
  ● PP Cryotube Vials behin eta berriz izoztu eta desizoztu daitezke
  ● Kanpoko txanoaren diseinuak kutsadura probabilitatea murrizten du laginaren tratamenduan zehar.
  ● Torlojuzko tapoi hodi kriogenikoak Erabiltzeko torloju hari unibertsalak
  ● Hodiak errotore arruntenetara egokitzen dira
  ● Hodi kriogenikoen o-ring-hodiak 1 hazbeteko eta 2 hazbeteko, 48 putzu, 81 putzu, 96 putzu eta 100 putzu izozkailu kaxetara egokitzen dira.
  ● Autoklabea 121°C-ra eta izozgarria -86°C-tara

  ZATIA ZENB	MATERIALA	BOLUMENA	CAPKOLOREA	PZ/POLTSUA	POLTSAK/KASOA
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Beltza, horia, urdina, gorria, morea, zuria	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Beltza, horia, urdina, gorria, morea, zuria	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Beltza, horia, urdina, gorria, morea, zuria	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	Beltza, horia, urdina, gorria, morea, zuria	500	10