Sarrera
Zer da azido nukleikoen erauzketa?
Termino oso sinpleenetan, azido nukleikoen erauzketa lagin batetik RNA eta/edo DNA eta beharrezkoa ez den gehiegizko guztia kentzea da. Erauzketa-prozesuak lagin batetik azido nukleikoak isolatzen ditu eta eluatu kontzentratu baten moduan ematen ditu, diluitzailerik eta kutsatzailerik gabe, beheranzko aplikazioetan eragina izan dezaketenak.
Azido Nukleikoen Erauzketaren Aplikazioak
Azido nukleiko araztuak aplikazio ugaritan erabiltzen dira, hainbat industriatan. Osasuna da beharbada gehien erabiltzen den eremua, ARN eta ADN araztuak behar diren hainbat probatarako helburu ezberdinetarako.
Azido nukleikoaren erauzketaren aplikazioak osasunean honako hauek dira:
- Hurrengo belaunaldiko sekuentziazioa (NGS)
- Anplifikazioan oinarritutako SNP Genotipatzea
- Array-en oinarritutako genotipatzea
- Murrizketa Entzimaren Digestioa
- Entzimak aldatzeko analisiak (adibidez, ligazioa eta klonazioa)
Azido nukleikoen erauzketa erabiltzen den osasun-arlotik haratago beste alor batzuk ere badaude, besteak beste, aitatasun-probak, auzitegiak eta genomika.
Azido Nukleikoen Erauzketaren Historia Laburra
DNA erauzteaaspaldikoa da, ezagutzen den lehen isolamendua Friedrich Miescher izeneko mediku suitzar batek egin baitzuen 1869an. Miescherrek zelulen konposizio kimikoa zehaztuz bizitzaren oinarrizko printzipioak ebaztea espero zuen. Linfozitoekin huts egin ondoren, botatako bendetan pusetan aurkitutako leukozitoetatik ADN hauspeatu gordina lortu ahal izan zuen. Hori egin zuen zelulari azidoa eta gero alkalia gehituz, zelularen zitoplasmatik irteteko, eta, ondoren, protokolo bat garatu zuen DNA beste proteinetatik bereizteko.
Miescherren ikerketa aitzindariari jarraituz, beste zientzialari askok DNA isolatu eta arazteko teknikak aurreratu eta garatzen joan dira. Edwin Joseph Cohn, proteina zientzialari batek proteinak arazteko teknika asko garatu zituen Bigarren Mundu Gerran. Odol plasmako albuminaren serumaren frakzioa isolatzeaz arduratu zen, eta hori garrantzitsua da odol-hodietako presio osmotikoa mantentzeko. Hau funtsezkoa zen soldaduak bizirik mantentzeko.
1953an Francis Crick-ek, Rosalind Franklin eta James Watsonekin batera, DNAren egitura zehaztu zuen, azido nukleikoen nukleotidoen kate luze bi kateez osatuta zegoela erakutsiz. Aurkikuntza aurrerapen honek bidea ireki zien Meselson eta Stahl-i, dentsitate-gradientearen zentrifugazio-protokolo bat garatu ahal izan baitzuten E. Coli bakterioetatik DNA isolatzeko, DNAren erreplikazio erdi-kontserbatiboa frogatu baitzuten 1958ko esperimentuan zehar.
Azido Nukleikoen Erauzketa Teknikak
Zeintzuk dira DNA erauzteko 4 faseak?
Erauzketa-metodo guztiak oinarrizko urrats berdinetara murrizten dira.
Zelulen haustura. Etapa honek, zelulen lisi izenez ere ezagutzen dena, zelularen horma edo/eta zelula-mintza haustea dakar, interesgarri diren azido nukleikoak dituzten zelula barneko fluidoak askatzeko.
Nahi ez diren hondakinak kentzea. Honek mintz-lipidoak, proteinak eta nahi ez diren beste azido nukleiko batzuk barne hartzen ditu, beherako aplikazioetan oztopatu dezaketenak.
Isolatze. Sortutako lisatu garbitik interesgarriak diren azido nukleikoak isolatzeko hainbat modu daude, bi kategoria nagusiren artean kokatzen direnak: disoluzio-oinarritutakoa edo egoera solidoa (ikus hurrengo atala).
Kontzentrazioa. Azido nukleikoak gainontzeko kutsatzaile eta diluitzaile guztietatik isolatu ondoren, oso kontzentratuta dagoen eluate batean aurkezten dira.
Bi Erauzketa Mota
Azido nukleikoen erauzketa bi mota daude: disoluzio bidezko metodoak eta egoera solidoko metodoak. Soluzioan oinarritutako metodoa erauzketa kimikoko metodoa bezala ere ezagutzen da, zelula apurtzeko eta material nukleikoa sartzeko produktu kimikoak erabiltzean datza. Honek konposatu organikoak erabili daitezke, hala nola fenola eta kloroformoa, edo hain kaltegarri eta gomendagarriagoak diren konposatu ez-organikoak, hala nola Proteinasa K edo silize gela.
Zelula bat apurtzeko erauzketa kimiko metodo ezberdinen adibideak hauek dira:
- Mintzaren haustura osmotikoa
- Hormaren digestio entzimatikoa
- Mintzaren solubilizazioa
- Garbigarriekin
- Tratamendu alkalinoarekin
Egoera solidoko teknikak, metodo mekaniko gisa ere ezagutzen direnak, DNA substratu solido batekin nola elkarreragiten duen ustiatzea dakar. ADNa lotuko den baina analitoa ez duen alea edo molekula bat hautatuz gero, posible da biak bereiztea. Fase solidoko erauzketa tekniken adibideak, besteak beste, silizea eta ale magnetikoak erabiliz.
Ale magnetikoen erauzketa azalduta
Ale magnetikoak erauzteko metodoa
Ale magnetikoak erabiliz ateratzeko ahalmena Trevor Hawkins-ek Whitehead Institute ikerketa-erakunderako AEBetako patente batean aitortu zen lehen aldiz. Patente honek onartzen zuen material genetikoa ateratzea posible zela euskarri solido bati lotuz, hau da, ale magnetiko bat izan zitekeela. Printzipioa zera da: oso funtzionalizatutako ale magnetiko bat erabiltzen duzula, zeinaren gainean material genetikoa lotuko den, eta, ondoren, gainnadantetik bereiz daiteke lagina duen ontziaren kanpoaldean indar magnetiko bat aplikatuz.
Zergatik erabili aleen erauzketa magnetikoa?
Ale magnetikoak erauzteko teknologia gero eta nagusiagoa da, erauzketa prozedura azkar eta eraginkorretarako daukan potentzialagatik. Azken boladan, oso funtzionalizatutako ale magnetikoen garapenak izan dira, buffer-sistema egokiekin, azido nukleikoen erauzketa automatizatzea eta baliabide arina eta kostu-eraginkorra den lan-fluxua posible egin dutenak. Gainera, ale magnetikoen erauzketa metodoek ez dute DNA zati luzeagoak hausten dituzten ebakidura-indarrak eragin ditzaketen zentrifugazio-pausoak inplikatzen. Horrek esan nahi du DNA-kate luzeagoak oso-osorik mantentzen direla, eta hori garrantzitsua da genomikako probetan.
Argitalpenaren ordua: 2022-12-25