Nahiz eta teorian txantiloiaren molekula bat nahikoa izango litzateke, normalean PCR klasikorako DNA kantitate dezente handiagoak erabiltzen dira, adibidez, ugaztun genomiko DNA 1 µg eta DNA plasmido 1 pg. Kopuru optimoa xede-sekuentziaren kopia kopuruaren araberakoa da neurri handi batean, baita bere konplexutasunaren arabera ere.
Oso txantiloi gutxi erabiltzen bada, produktu kopuru nahikoa lortzeko anplifikazio-ziklo kopuruaren igoera beharrezkoa izango da. PCR esperimentu gehienetarako erabiltzen den Taq polimerasa batek ez du zuzenketa-funtziorik (3′-5′ exonukleasaren jarduera); horrela, anplifikazioan gertatzen diren akatsak ezin dira zuzendu. Zenbat eta ziklo kopurua handiagoa izan, orduan eta nagusiagoa izango da produktu akastunaren anplifikazioa. Aldiz, txantiloi-kopurua handiegia bada, abiarazleak beste sekuentzia batzuekin (ez ehuneko ehuneko osagarriak) errekostatzeko probabilitatea handitu egingo da, baita primer-dimeroak sortzea ere, eta horrek anplifikazioa eragingo du. azpiproduktuak. Kasu askotan, DNA zelula-kulturetatik edo mikroorganismoetatik isolatzen da eta, ondoren, PCR txantiloi gisa erabiltzen da. Arazketa ondoren, DNAren kontzentrazioa zehaztu behar da PCR konfiguratzeko behar den bolumena definitu ahal izateko. Agarosa gel elektroforesiak estimazio bat emateko balio dezakeen arren, metodo hau ez da zehatza. UV-Vis espektrofotometria azido nukleikoen kuantifikaziorako urrezko estandar gisa ezarri da; metodo zuzen honek, beraz, erraz eta azkar honek laginaren xurgapena neurtzen du 260 nm-tan, eta kontzentrazioa konbertsio-faktore baten laguntzaz kalkulatzen da.
DNAren kontzentrazioa oso baxua bada, ordea (< 1 µg/mL dsDNA), edo 260 nm-ko tartean ere xurgatzen duten substantziekin kutsatuta badago (adibidez, RNA, proteina, gatzak), metodo honek bere mugak lortuko ditu. Oso kontzentrazio baxuen kasuan, irakurketak laster zehaztasun handiegiak bihurtuko dira erabiltzeko, eta kutsadurak benetako balioa gainbaloratzea ekarriko du (batzuetan izugarria). Kasu honetan, fluoreszentzia erabiliz kuantifikatzeak alternatiba bat aurkez dezake. Teknika hau dsDNArekin bereziki lotzen den koloratzaile fluoreszente baten erabileran oinarritzen da, azido nukleikoak eta koloratzaileak osatutako konplexua soilik argiak kitzikatzen du, eta, ondoren, uhin-luzera apur bat handiagoko argia igorriko du. Hemen, seinale fluoreszentearen intentsitatea DNA kantitatearekiko proportzionala da, eta kontzentrazioa zehazteko kurba estandar baten arabera ebaluatzen da. Metodo honen abantailak loturaren espezifikotasunean oinarritzen dira, kutsadurak eragindako kanpo-eraginak baztertzen dituena, baita DNAren kontzentrazio oso baxuak detektatzeko gaitasunean ere. Bi metodoen egokitasuna laginaren kontzentrazio eta garbitasunaren araberakoa da batez ere; kasu askotan, bi metodoak paraleloan aplikatzea ere komenigarria izan daiteke.
Argitalpenaren ordua: 2022-11-30