Edukate amplifikatsioonireaktsioonide jaoks on vajalik, et üksikud reaktsioonikomponendid oleksid igas preparaadis õiges kontsentratsioonis. Lisaks on oluline, et ei esineks saastumist.
Eriti kui on vaja seadistada palju reaktsioone, on iga reaktiivi igasse anumasse eraldi pipetimise asemel ette nähtud nn põhisegu valmistamine. Kaubanduslikult on saadaval eelkonfigureeritud segud, millesse lisatakse ainult proovispetsiifilised komponendid (praimer) ja vesi. Teise võimalusena saate põhisegu ise valmistada. Mõlema variandi puhul jaotatakse segu igasse PCR anumasse ilma matriitsita ja individuaalne DNA proov lisatakse lõpus eraldi.
Põhisegu kasutamisel on mitmeid eeliseid: Esiteks väheneb üksikute pipeteerimisetappide arv. Nii minimeeritakse nii kasutaja vigade oht pipeteerimisel kui ka saastumise oht ning loomulikult hoitakse kokku aega. Põhimõtteliselt on ka pipeteerimise täpsus suurem, kuna doseeritakse suuremaid koguseid. Pipettide tehnilisi andmeid kontrollides on seda lihtne mõista: Mida väiksem on doseeritud maht, seda suuremad võivad olla kõrvalekalded. Asjaolu, et kõik preparaadid pärinevad ühest anumast, avaldab positiivset mõju homogeensusele (kui see on hästi segatud). See parandab ka katsete reprodutseeritavust.
Põhisegu valmistamisel tuleks lisada vähemalt 10% lisamahtu (nt kui on vaja 10 preparaati, arvutage 11 põhjal), et ka viimane anum saaks korralikult täidetud. Sel viisil saab kompenseerida (kergeid) pipetimise ebatäpsusi ja proovi kadumise mõju pesuainet sisaldavate lahuste doseerimisel. Detergendid sisalduvad ensüümilahustes, nagu polümeraasid ja põhisegud, põhjustades vahu moodustumist ja jääke tavaliste vedelike sisepinnal.pipetiotsad.
Sõltuvalt rakendusest ja doseeritava vedeliku tüübist tuleb valida õige pipeteerimistehnika (1) ja valida sobiv varustus. Pesuaineid sisaldavate lahuste puhul on õhupatjadega pipettide alternatiivina soovitatav kasutada otsenihkesüsteemi või niinimetatud madala retentsiooniga pipetiotsikuid. MõjuACE PIPETTI otspõhineb eriti hüdrofoobsel pinnal. Pesuaineid sisaldavad vedelikud ei jäta sisse- ega väljapoole jääkkilet, nii et lahuse kadu saab minimeerida.
Lisaks kõikide komponentide täpsele doseerimisele on oluline ka see, et preparaadid ei saastu. Kõrge puhtusastmega kulumaterjalide kasutamisest ei piisa, sest õhkpadjaga pipetiga pipeteerimisel võib tekkida aerosoole, mis jäävad pipetti. Aerosoolis sisalduvat DNA-d saab järgmises pipetimisetapis ühest proovist teise üle kanda ja seeläbi põhjustada saastumist. Eespool nimetatud otsenihkesüsteemid võivad samuti seda riski minimeerida. Õhkpadjaga pipettide puhul on mõttekas kasutada filtriotsikuid, et kaitsta pipeti koonust pritsmete, aerosoolide ja biomolekulide säilitamise kaudu.
Postitusaeg: 06. detsember 2022