Krüoviaalidkasutatakse tavaliselt rakuliinide ja muude kriitiliste bioloogiliste materjalide krüogeenseks säilitamiseks vedela lämmastikuga täidetud dewaris.

Rakkude edukas säilitamises vedelas lämmastikus on mitu etappi. Kuigi põhiprintsiip on aeglane külmutamine, sõltub täpne kasutatav tehnika rakutüübist ja kasutatavast krüoprotektorist. Rakkude nii madalatel temperatuuridel hoidmisel tuleb arvestada mitmete ohutuskaalutluste ja parimate tavadega.

Selle postituse eesmärk on anda ülevaade sellest, kuidas krüoviaale vedelas lämmastikus hoitakse.

Mis on krüoviaalid

Krüoviaalid on väikesed korgiga viaalid, mis on mõeldud vedelate proovide hoidmiseks äärmiselt madalatel temperatuuridel. Need tagavad, et krüoprotektandis säilinud rakud ei puutu otseselt kokku vedela lämmastikuga, minimeerides rakumurdude riski, saades samas kasu vedela lämmastiku äärmisest jahutavast toimest.

Viaalid on tavaliselt saadaval erineva mahu ja kujundusega – need võivad olla sise- või väliskeermega lameda või ümara põhjaga. Saadaval on ka steriilsed ja mittesteriilsed vormingud.

Kes kasutabCyrovialsrakkude säilitamiseks vedelas lämmastikus

Mitmed NHS-i ja eralaborid, samuti nabaväädivere pangandusele, epiteelirakkude bioloogiale, immunoloogiale ja tüvirakkude bioloogiale spetsialiseerunud uurimisasutused kasutavad rakkude külmsäilitamiseks krüoviaale.

Sel viisil säilitatavate rakkude hulka kuuluvad B- ja T-rakud, CHO-rakud, vereloome tüvirakud ja eellasrakud, hübridoomid, soolerakud, makrofaagid, mesenhümaalsed tüvirakud ja eellasrakud, monotsüüdid, müeloom, NK-rakud ja pluripotentsed tüvirakud.

Ülevaade krüoviaalide hoidmisest vedelas lämmastikus

Krüokonserveerimine on protsess, mis säilitab rakke ja muid bioloogilisi konstruktsioone, jahutades neid väga madalale temperatuurile. Rakke võib vedelas lämmastikus säilitada aastaid, ilma et rakkude elujõulisus väheneks. See on kasutatud protseduuride ülevaade.

Rakkude ettevalmistamine

Proovide valmistamise täpne meetod varieerub sõltuvalt rakutüübist, kuid üldiselt kogutakse rakud kokku ja tsentrifuugitakse, et tekiks rakurikas pellet. See pellet resuspendeeritakse seejärel supernatandis, mis on segatud külmutuskaitsevahendi või külmsäilitussöötmega.

Krüosäilituskeskkond

Seda söödet kasutatakse rakkude säilitamiseks madala temperatuuriga keskkondades, millele nad alluvad, pärssides rakusiseste ja rakuväliste kristallide moodustumist ja seega rakusurma. Nende ülesanne on pakkuda rakkudele ja kudedele ohutut ja kaitsvat keskkonda külmutamise, säilitamise ja sulatamise ajal.

Sööde, nagu värskelt külmutatud plasma (FFP), hepariniseeritud plasmalüüdi lahus või seerumivabad loomsete komponentide vabad lahused, segatakse krüoprotektantidega, nagu dimetüülsulfoksiid (DMSO) või glütserool.

Taasvedeldatud proovigraanul jagatakse alikvootidega polüpropüleenist krüoviaalidesse, näiteksSuzhou Ace biomeditsiiniettevõtte krüogeensed säilitusviaalid.

Oluline on mitte krüoviaale üle täita, kuna see suurendab pragunemise ohtu ja sisu võimalikku vabanemist (1).

Kontrollitud külmumiskiirus

Üldiselt kasutatakse rakkude edukaks külmsäilitamiseks aeglast kontrollitud külmumiskiirust.

Pärast proovide alikvootimist krüogeensetesse viaalidesse asetatakse need märjale jääle või külmikusse temperatuuril 4 ℃ ja külmutamist alustatakse 5 minuti jooksul. Üldjuhul jahutatakse rakke kiirusega -1 kuni -3 minutis (2). See saavutatakse programmeeritava jahuti abil või asetades viaalid isoleeritud karpi, mis asetatakse –70 °C kuni –90 °C reguleeritava kiirusega sügavkülmikusse.

Viige üle vedelasse lämmastikku

Külmutatud krüogeensed viaalid viiakse seejärel määramata ajaks vedela lämmastiku mahutisse, tingimusel et temperatuur on alla -135 ℃.

Neid ülimadalaid temperatuure saab saavutada vedelas või aurufaasis lämmastikku sukeldamisega.

Vedel või aurufaas?

Ladustamine vedelas faasis lämmastikus säilitab teadaolevalt absoluutse konsistentsiga külma temperatuuri, kuid seda ei soovitata sageli järgmistel põhjustel:

• Vajadus suures koguses (sügavuses) vedela lämmastiku järele, mis on potentsiaalne oht. Sellest tulenevad põletused või lämbumine on reaalne oht.
• Dokumenteeritud ristsaastumise juhtumid nakkustekitajatega, nagu aspergillus, hep B ja viiruse levik vedela lämmastiku kaudu (2,3)
• Vedela lämmastiku lekkimine viaalidesse kastmise ajal. Laost välja võttes ja toatemperatuurini soojendades paisub lämmastik kiiresti. Järelikult võib viaal vedela lämmastiku hoidlast eemaldamisel puruneda, tekitades ohu nii lendava prahi kui ka sisuga kokkupuute tõttu (1, 4).

Nendel põhjustel säilitatakse ülimadala temperatuuriga kõige sagedamini aurufaasis lämmastikus. Kui proove tuleb hoida vedelas faasis, tuleks kasutada spetsiaalseid krüoflexi torusid.

Aurufaasi negatiivne külg on see, et võib tekkida vertikaalne temperatuurigradient, mille tulemuseks on temperatuurikõikumised vahemikus -135 ℃ kuni -190 ℃. See nõuab vedela lämmastiku taseme ja temperatuurimuutuste hoolikat ja hoolikat jälgimist (5).

Paljud tootjad soovitavad, et krüoviaalid sobivad säilitamiseks kuni -135 ℃ või kasutamiseks ainult aurufaasis.

Teie külmsäilitatud rakkude sulatamine

Sulatamisprotseduur on külmutatud kultuuri jaoks stressirohke ning rakkude optimaalse elujõulisuse, taastumise ja funktsionaalsuse tagamiseks on vajalik nõuetekohane käsitsemine ja tehnika. Täpsed sulatamisprotokollid sõltuvad konkreetsetest rakutüüpidest. Siiski peetakse kiiret sulatamist standardseks:

• Vähendage mõju raku taastumisele
• Aidake vähendada kokkupuuteaega külmutuskeskkonnas olevate lahustunud ainetega
• Minimeerige jää ümberkristallimisest põhjustatud kahju

Proovide sulatamiseks kasutatakse tavaliselt veevanne, helmevanne või spetsiaalseid automatiseeritud seadmeid.

Kõige sagedamini sulatatakse 1 rakuliin korraga 1–2 minuti jooksul, keerutades õrnalt 37-kraadises veevannis, kuni viaalis on jäänud vaid väike jäätükk, enne kui neid pestakse eelsoojendatud kasvusöötmes.

Mõnede rakkude, näiteks imetajate embrüote puhul on aeglane soojenemine nende ellujäämiseks hädavajalik.

Rakud on nüüd valmis rakukultuuriks, rakkude isoleerimiseks või vereloome tüvirakkude puhul elujõulisuse uuringuteks, et tagada doonortüvirakkude terviklikkus enne müeloablatiivset ravi.

Tavapärane on võtta väikesed alikvoodid eelpestud proovist, mida kasutatakse rakkude loendamiseks, et määrata rakkude kontsentratsioonid kultuuris külvamiseks. Seejärel saate hinnata rakkude eraldamise protseduuride tulemusi ja määrata rakkude elujõulisust.

Krüoviaalide säilitamise parimad tavad

Krüoviaalides säilitatavate proovide edukas külmsäilitamine sõltub paljudest protokolli elementidest, sealhulgas nõuetekohasest säilitamisest ja arvestuse pidamisest.

• Jagage lahtrid salvestuskohtade vahel– Kui mahud lubavad, jagage rakud viaalide vahel ja hoidke neid erinevates kohtades, et vähendada seadmete riketest tingitud proovi kadumise ohtu.
• Vältida ristsaastumist– Valige enne järgnevat kasutamist ühekordselt kasutatavad steriilsed krüogeensed viaalid või autoklaavi
• Kasutage oma rakkude jaoks sobiva suurusega viaale– viaalide maht on vahemikus 1 kuni 5 ml. Vältige viaalide ületäitmist, et vähendada pragunemise ohtu.
• Valige sise- või väliskeermega krüogeensed viaalid– Mõned ülikoolid soovitavad turvameetmeteks kasutada sisekeermega viaale – need võivad ka täitmise ajal või vedelas lämmastikus hoidmisel vältida saastumist.
• Vältida leket- Lekke ja saastumise vältimiseks kasutage keeratava korgi või O-rõngaste sisse vormitud kahekordse sissepritsega tihendeid.
• Kasutage 2D vöötkoode ja sildistatud pudeleid– jälgitavuse tagamiseks võimaldavad suurte kirjutusaladega viaalid iga viaali piisavalt märgistada. 2D vöötkoodid võivad aidata salvestusruumi haldamisel ja andmete säilitamisel. Värvikoodiga korgid on kasulikud lihtsamaks tuvastamiseks.
• Ladustuse piisav hooldus- Rakkude kadumise tagamiseks peaksid säilitusanumad pidevalt jälgima temperatuuri ja vedela lämmastiku taset. Häired peaksid olema paigaldatud, et hoiatada kasutajaid vigadest.

Ohutusmeetmed

Vedel lämmastik on tänapäevastes uuringutes muutunud tavapäraseks tavaks, kuid vale kasutamise korral kaasneb sellega tõsiste vigastuste oht.

Vedela lämmastiku käitlemisel tuleb kasutada sobivaid isikukaitsevahendeid, et minimeerida külmumiskahjustuste, põletuste ja muude ebasoodsate juhtumite ohtu. Kanda

• Krüogeensed kindad
• Laborikate
• Löögikindel kogu näokaitse, mis katab ka kaela
• Kinnise ninaga kingad
• Pritsmekindel plastikust põll

Vedela lämmastikuga külmikud tuleks paigutada hästi ventileeritavasse kohta, et minimeerida lämbumisohtu – välja pääsenud lämmastik aurustub ja tõrjub välja õhuhapniku. Suuremahulistes kauplustes peaksid olema madala hapnikusisaldusega häiresüsteemid.

Paaris töötamine vedela lämmastiku käitlemisel on ideaalne ja selle kasutamine väljaspool tavapärast tööaega peaks olema keelatud.

Krüoviaalid teie töövoo toetamiseks

Ettevõte Suzhou Ace Biomedical pakub laia valikut tooteid, mis vastavad teie eri tüüpi rakkude külmsäilitamise vajadustele. Portfellis on nii torusid kui ka steriilseid krüoviaale.

Meie krüoviaalid on:

• Labi keeratav kork 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml krüoviaalsed krüogeensed viaalid koonilise põhjaga krüotoru koos tihendiga

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml spetsifikatsioon, seelikuga või ilma
  ● Saadaval on nii kooniline kui ka iseseisev disain, steriilne või mittesteriilne
  ● Keeratava korgiga torud on valmistatud meditsiinilisest polüpropüleenist
  ● PP krüotuubi viaale saab korduvalt külmutada ja üles sulatada
  ● Välise korgi konstruktsioon võib proovi töötlemise ajal vähendada saastumise tõenäosust.
  ● Keeratava korgiga krüogeensed torud Universaalsed kruvikeermed kasutamiseks
  ● Torud sobivad kõige tavalisematele rootoritele
  ● Krüogeensete torude o-rõngastorud sobivad standardsetele 1- ja 2-tollistele, 48-, 81-, 96- ja 100-süvendiga sügavkülmakastidele.
  ● Autoklaavitav kuni 121°C ja külmutatav kuni -86°C

  OSA NR	MATERJAL	VOLUME	ÜPPVÄRV	PCS/KOTTI	KOTID/KOHT
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Must, kollane, sinine, punane, lilla, valge	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Must, kollane, sinine, punane, lilla, valge	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Must, kollane, sinine, punane, lilla, valge	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Must, kollane, sinine, punane, lilla, valge	500	10