Protsesside standardimine hõlmab nende optimeerimist ning sellele järgnevat loomist ja ühtlustamist, võimaldades pikaajalist optimaalset jõudlust-kasutajast sõltumatu. Standardimine tagab kvaliteetse tulemuse, samuti nende reprodutseeritavuse ja võrreldavuse.
(Classic) PCR eesmärk on usaldusväärse ja reprodutseeritava tulemuse genereerimine. Teatud rakenduste jaoksPCR -toodeon ka asjakohane. Nende reaktsioonide jaoks tuleb olla ettevaatlik tagamaks, et proovid ei kahjustaks ja PCR -i töövoog püsib stabiilsena. Täpsemalt, see tähendab saastumiste kehtestamise minimeerimist, mis võib põhjustada valepositiivseid või valenegatiivseid tulemusi või pärssida isegi PCR -reaktsiooni. Lisaks peaksid reaktsioonitingimused olema võimalikult identsed igas käiguvahendis ja ka edastatavaks järgnevatele reaktsioonidele (sama meetodile). See viitab nii reaktsioonide koostisele kui ka tsükli temperatuuri juhtimise tüübile. Kasutajavigu tuleb muidugi võimalikult palju vältida.
Allpool demonstreerime väljakutseid, mis on ettevalmistamise ajal ja kogu PCR -i käitamise ajal - ning lähenemisviise lahendustele, mis eksisteerivad PCR -i töövoogude standardimiseks kasutatavate instrumentide ja tarbekaupade osas.
Reaktsiooni ettevalmistamine
Reaktsioonikomponentide väljastamine vastavalt PCR-veresoonteks või taldrikuteks sisaldab mitmeid väljakutseid, millest tuleb üle saada:
Reaktsioonitingimused
Üksikute komponentide täpne ja täpne annustamine on võimalikult ühesugusemate reaktsioonitingimuste eesmärk. Lisaks heale pipeteerimistehnikale on kriitiline ka õige tööriista valimine. PCR-magistri segud sisaldavad sageli aineid, mis suurendavad viskoossust või tekitavad vahtu. Pipeteerimisprotsessi ajal põhjustavad need olulist niisutamistpipeti näpunäited, vähendades sellega pipeteerimise täpsust. Otseste väljastussüsteemide või alternatiivsete pipeti näpunäidete kasutamine, mis on niisutamisele vähem altid, võib parandada pipeteerimisprotsessi täpsust ja täpsust.
Saastumine
Väljastusprotsessi käigus genereeritakse aerosoolid, mis võimaldavad pipeti sisemusse jõuda järgmise pipeteerimise etapi ajal potentsiaalselt teist proovi. Seda saab ära hoida, kasutades filtriotsid või otsesed nihkesüsteemid.
Sellised tarbekaubad nagunäpunäited, PCR -i töövoogudes kasutatavad anumad ja taldrikud ei tohi sisaldada aineid, mis kahjustavad proovi või võltsida tulemust. Nende hulka kuuluvad DNA, DNasid, RNasid ja PCR inhibiitorid, samuti komponendid, mis võivad reaktsiooni ajal materjalist leotada - aineid, mida tuntakse leostumistega.
Kasutajaviga
Mida rohkem proove töödeldakse, seda suurem on vearisk. Võib hõlpsalt juhtuda, et proov on torutatud valesse anumasse või valesse kaevu. Seda riski saab märkimisväärselt vähendada kaevude hõlpsasti märgatava märgistamise teel. Väljastamise etappide automatiseerimise kaudu minimeeritakse „inimtegur”, st vigu ja kasutajaga seotud variatsioone, suurendades seega reprodutseeritavust, eriti väikeste reaktsioonimahtude korral. See nõuab tööjaamas kasutamist piisava mõõtmete stabiilsusega plaate. Manustatud vöötkoodid pakuvad täiendavat masinardatavust, mis lihtsustab proovi jälgimist kogu protsessi vältel.
Termotsükli programmeerimine
Instrumendi programmeerimine võib osutuda nii aeganõudvaks kui ka tõrkeohtlikuks. Erinevad PCR -i termilise tsükli funktsioonid töötavad koos selle protsessi sammu lihtsustamiseks ja mis kõige tähtsam, et see ohutuks muuta:
Lihtne töö ja hea kasutaja juhendamine on tõhusa programmeerimise alus. Sellele vundamendile tuginedes takistab parooliga kaitstud kasutajahaldust teiste kasutajate enda programmide muutmise. Kui kasutusel on mitu (sama tüüpi) tsüklit, on kasulik, kui programmi saab USB või ühenduvuse kaudu otse ühest instrumendist teise üle kanda. Arvutitarkvara võimaldab arvutis programmide, kasutajaõiguste ja dokumentide keskset ja turvalist haldamist.
PCR Run
Jooksu ajal amplifitseeritakse DNA reaktsioonianumas, kus iga proov tuleks alluda identsetele, järjepidevatele reaktsioonitingimustele. Protsessi jaoks on olulised järgmised aspektid:
Temperatuurikontroll
Kõigi proovide ühtlase temperatuuri konditsioneerimise aluseks on tsükliploki temperatuuri kontrolli ja homogeensuse suurepärane täpsus. Kütte- ja jahutuselementide kõrge kvaliteet (Peltier Elements), aga ka viis, kuidas need on plokiga ühendatud, on otsustavad tegurid, mis määravad temperatuuri lahknevuse riski, mida nimetatakse servaefektiks
Aurustumine
Üksikute reaktsioonikomponentide kontsentratsioonid ei tohiks aurustumise tõttu reaktsiooni käigus muutuda. Muidu on võimalik, et väga vähePCR -toodevõib genereerida või üldse mitte. Seetõttu on ülioluline aurustumise minimeerimine, tagades turvalise pitseri. Sel juhul töötavad termotsükli kuumutatud kaas ja laeva pitser käsikäes. Saadaval on erinevad tihendusvõimalusedPCR -plaadid (link: tihendusartikkel), kusjuures parim pitser saavutatakse soojuse tihendamise kaudu. Muud sulgurid võivad olla sobivad, kui tsükli kaane kontaktrõhku saab valitud tihendiga reguleerida.
Protsessi standardimine on paigas, et kaitsta pikaajaliselt täpseid ja reprodutseeritavaid tulemusi. See hõlmab seadmete regulaarset hooldust, et tagada see alati heas töökorras. Kõik tarbekaubad peaksid olema kõigi toodetud partiide järjepidevalt kõrge kvaliteediga ja nende usaldusväärne saadavus tuleb tagada.
Postiaeg: 29. november 20122