Protsesside standardiseerimine hõlmab nende optimeerimist ja sellele järgnevat kehtestamist ja ühtlustamist, võimaldades pikaajalist optimaalset jõudlust – sõltumata kasutajast. Standardimine tagab kvaliteetsed tulemused, aga ka nende reprodutseeritavuse ja võrreldavuse.
(Klassikalise) PCR-i eesmärk on usaldusväärse ja reprodutseeritava tulemuse genereerimine. Teatud rakenduste puhul on tootlusPCR toodeon samuti asjakohane. Nende reaktsioonide puhul tuleb hoolitseda selle eest, et proovid ei kahjustataks ja et PCR töövoog jääks stabiilseks. Täpsemalt tähendab see saasteainete sissetoomise minimeerimist, mis võib viia valepositiivsete või valenegatiivsete tulemusteni või isegi pärssida PCR reaktsiooni. Peale selle peaksid reaktsioonitingimused olema võimalikult identsed iga üksiku proovi jaoks tsükli jooksul ja olema ülekantavad ka järgmistele reaktsioonidele (sama meetodiga). See viitab nii reaktsioonide koostisele kui ka tsükleri temperatuuri reguleerimise tüübile. Loomulikult tuleb võimalikult palju vältida kasutaja vigu.
Allpool tutvustame väljakutseid, millega PCR ettevalmistamisel ja selle käigus kokku puututakse – ning lähenemisviise lahendustele, mis on seotud PCR-i töövoogude standardiseerimiseks kasutatavate instrumentide ja kulumaterjalidega.
Reaktsiooni ettevalmistamine
Reaktsioonikomponentide jagamine vastavalt PCR-anumatesse või plaatidesse hõlmab mitmeid väljakutseid, millest tuleb üle saada:
Reaktsioonitingimused
Üksikute komponentide täpne ja täpne doseerimine on võimalikult identsete reaktsioonitingimuste saavutamiseks hädavajalik. Lisaks heale pipeteerimistehnikale on oluline valida õige tööriist. PCR-i põhisegud sisaldavad sageli aineid, mis suurendavad viskoossust või tekitavad vahtu. Pipeteerimisprotsessi ajal põhjustavad need vedelike märkimisväärset märgumistpipetiotsad, vähendades seega pipetimise täpsust. Otsese doseerimissüsteemide või alternatiivsete pipetiotsikute kasutamine, mis on vähem altid märgumisele, võib parandada pipeteerimisprotsessi täpsust ja täpsust.
Saastumised
Väljastusprotsessi käigus tekivad aerosoolid, mis, kui neil lastakse pipeti sisemusse jõuda, võivad järgmise pipetimisetapi käigus saastada teise proovi. Seda saab vältida filtriotsikute või otsenihkesüsteemide abil.
Kulumaterjalid nagunäpunäiteid, anumad ja plaadid, mida kasutatakse PCR töövoos, ei tohi sisaldada aineid, mis kahjustavad proovi või võltsivad tulemust. Nende hulka kuuluvad DNA, DNaasid, RNaasid ja PCR inhibiitorid, samuti komponendid, mis võivad reaktsiooni käigus materjalist leostuda – ained, mida nimetatakse leostuvateks aineteks.
Kasutaja viga
Mida rohkem proove töödeldakse, seda suurem on vearisk. Kergesti võib juhtuda, et proov pipeteeritakse valesse anumasse või valesse kaevu. Seda riski saab oluliselt vähendada kaevude kergesti märgatava märgistamise abil. Väljastamisetappide automatiseerimisega minimeeritakse “inimfaktor”, st vead ja kasutajaga seotud variatsioonid, suurendades seeläbi reprodutseeritavust, eriti väikeste reaktsioonimahtude korral. See eeldab piisava mõõtmete stabiilsusega plaatide kasutamist tööjaamas. Kinnitatud vöötkoodid pakuvad täiendavat masinloetavust, mis lihtsustab proovide jälgimist kogu protsessi vältel.
Termotsükleri programmeerimine
Instrumendi programmeerimine võib osutuda nii aeganõudvaks kui ka veaohtlikuks. Erinevad PCR termotsükleri funktsioonid töötavad koos, et seda protsessietappi lihtsustada ja, mis kõige tähtsam, muuta see ohutuks:
Lihtne kasutamine ja hea kasutajajuhend on tõhusa programmeerimise aluseks. Sellele alusele toetudes väldib parooliga kaitstud kasutajate haldus, et teised kasutajad saaksid oma programme muuta. Kui kasutusel on mitu (sama tüüpi) tsiklit, on kasulik, kui programmi saab USB või ühenduse kaudu otse ühelt instrumendilt teisele üle kanda. Arvutitarkvara võimaldab keskselt ja turvaliselt hallata programme, kasutajaõigusi ja dokumente arvutis.
PCR jooks
Käitamise ajal amplifitseeritakse DNA reaktsioonianumas, kus iga proovi suhtes tuleb rakendada identseid ja ühtseid reaktsioonitingimusi. Protsessi jaoks on olulised järgmised aspektid:
Temperatuuri reguleerimine
Suurepärane temperatuuri reguleerimise täpsus ja tsükliploki homogeensus on kõigi proovide ühtlase temperatuuri konditsioneerimise aluseks. Kütte- ja jahutuselementide (peltier-elementide) kõrge kvaliteet, samuti nende plokiga ühendamise viis on otsustavad tegurid, mis määravad ära temperatuuride erinevuste ohu, mida nimetatakse servaefektiks.
Aurustumine
Üksikute reaktsioonikomponentide kontsentratsioonid ei tohiks reaktsiooni käigus aurustumise tõttu muutuda. Muidu on võimalik, et väga vähePCR toodevõib genereerida või üldse mitte. Seetõttu on ülioluline minimeerida aurustumist, tagades turvalise tihendi. Sel juhul töötavad termotsükleri soojendusega kaas ja anuma tihend käsikäes. Saadaval on erinevad tihendusvalikudPCR-plaadid (link: tihendusartikkel), kusjuures parim tihendus saavutatakse kuumtihendamise teel. Sobivad võivad olla ka muud sulgurid, kui tsikli kaane kontaktrõhku saab reguleerida vastavalt valitud tihendile.
Protsesside standardimine on paigas, et tagada täpsed ja reprodutseeritavad tulemused pikas perspektiivis. See hõlmab seadmete regulaarset hooldust, et tagada nende alati hea töökord. Kõik kulumaterjalid peavad olema kõikide toodetud partiide lõikes ühtlaselt kvaliteetsed ja nende usaldusväärne kättesaadavus peab olema tagatud.
Postitusaeg: 29.11.2022