Sissejuhatus
Mis on nukleiinhapete ekstraheerimine?
Kõige lihtsamalt öeldes tähendab nukleiinhappe ekstraheerimine RNA ja/või DNA eemaldamist proovist ning kogu mittevajaliku ülejäägi eemaldamist. Ekstraheerimise käigus isoleeritakse nukleiinhapped proovist ja saadakse need kontsentreeritud eluaadina, mis ei sisalda lahjendeid ega saasteaineid, mis võivad mõjutada mis tahes järgnevaid rakendusi.
Nukleiinhapete ekstraheerimise rakendused
Puhastatud nukleiinhappeid kasutatakse paljudes erinevates rakendustes, mis ulatuvad erinevatest tööstusharudest. Tervishoid on võib-olla valdkond, kus seda kasutatakse kõige rohkem, kuna puhastatud RNA-d ja DNA-d on vaja paljude erinevate testimise eesmärkide jaoks.
Nukleiinhapete ekstraheerimise rakendused tervishoius hõlmavad järgmist:
- Järgmise põlvkonna järjestus (NGS)
- Amplifikatsioonipõhine SNP genotüüpimine
- Massiivipõhine genotüüpimine
- Ensüümi seedimise piiramine
- Analüüsid, kasutades modifitseerivaid ensüüme (nt ligeerimine ja kloonimine)
Lisaks tervishoiule on ka muid valdkondi, kus kasutatakse nukleiinhapete ekstraheerimist, sealhulgas, kuid mitte ainult, isaduse testimine, kohtuekspertiisi ja genoomika.
Nukleiinhapete ekstraheerimise lühiajalugu
DNA ekstraheeriminepärineb ammusest ajast, esimese teadaoleva isoleerimise viis läbi Šveitsi arst Friedrich Miescher 1869. aastal. Miescher lootis rakkude keemilise koostise määramisega lahendada elu aluspõhimõtted. Pärast ebaõnnestumist lümfotsüütidega suutis ta saada DNA töötlemata sademe leukotsüütidest, mis leiti äravisatud sidemete mädast. Ta tegi seda, lisades rakule hapet ja seejärel leelist, et lahkuda raku tsütoplasmast, ning seejärel töötas välja protokolli DNA eraldamiseks teistest valkudest.
Pärast Miescheri murrangulist uurimistööd on paljud teised teadlased jätkanud DNA eraldamise ja puhastamise tehnikate edasiarendamist ja väljatöötamist. Edwin Joseph Cohn, valguteadlane, töötas Teise maailmasõja ajal välja palju valgu puhastamise meetodeid. Ta vastutas vereplasma seerumi albumiini fraktsiooni eraldamise eest, mis on oluline osmootse rõhu säilitamisel veresoontes. See oli sõdurite elushoidmiseks ülioluline.
1953. aastal määras Francis Crick koos Rosalind Franklini ja James Watsoniga DNA struktuuri, näidates, et see koosneb kahest pikast nukleiinhappenukleotiidide ahelast. See läbimurdeline avastus sillutas teed Meselsonile ja Stahlile, kes suutsid välja töötada tihedusgradient-tsentrifuugimise protokolli DNA eraldamiseks E. Coli bakteritest, kuna nad demonstreerisid DNA poolkonservatiivset replikatsiooni oma 1958. aasta katse käigus.
Nukleiinhapete ekstraheerimise tehnikad
Millised on DNA ekstraheerimise 4 etappi?
Kõik ekstraheerimismeetodid taanduvad samadele põhietappidele.
Rakkude katkestamine. See etapp, mida tuntakse ka kui rakulüüsi, hõlmab rakuseina ja/või rakumembraani lõhkumist, et vabastada huvipakkuvaid nukleiinhappeid sisaldavad rakusisesed vedelikud.
Soovimatu prügi eemaldamine. See hõlmab membraani lipiide, valke ja muid soovimatuid nukleiinhappeid, mis võivad segada allavoolu rakendusi.
Isolatsioon. Huvipakkuvate nukleiinhapete eraldamiseks teie loodud puhastatud lüsaadist on mitmeid erinevaid viise, mis jagunevad kahte põhikategooriasse: lahusel põhinev või tahke olek (vt järgmist jaotist).
Keskendumine. Pärast seda, kui nukleiinhapped on eraldatud kõigist muudest saasteainetest ja lahjenditest, esitatakse need kõrge kontsentratsiooniga eluaadis.
Kaks ekstraheerimise tüüpi
Nukleiinhapete ekstraheerimist on kahte tüüpi – lahusepõhised meetodid ja tahkismeetodid. Lahusepõhist meetodit tuntakse ka kui keemilise ekstraheerimise meetodit, kuna see hõlmab kemikaalide kasutamist raku lõhustamiseks ja nukleiinmaterjalile juurdepääsuks. Selleks võib kasutada kas orgaanilisi ühendeid, nagu fenool ja kloroform, või vähem kahjulikke ja seetõttu soovitatavamaid anorgaanilisi ühendeid, nagu proteinaas K või silikageel.
Erinevate keemiliste ekstraheerimismeetodite näited raku purustamiseks on järgmised:
- membraani osmootne purunemine
- Rakuseina ensümaatiline seedimine
- Membraani lahustumine
- Pesuvahenditega
- Leelistöötlusega
Tahkistehnikad, tuntud ka kui mehaanilised meetodid, hõlmavad DNA ja tahke substraadi vastasmõju kasutamist. Valides helme või molekuli, millega DNA seondub, kuid analüüt mitte, on võimalik need kaks eraldada. Näited tahkefaasilise ekstraheerimise tehnikatest, sealhulgas ränidioksiidi ja magnethelmeste kasutamine.
Magnethelmeste ekstraheerimise selgitus
Magnethelmeste ekstraheerimise meetod
Magnethelmeste abil ekstraheerimise potentsiaali tunnistati esmakordselt USA patendis, mille Trevor Hawkins esitas Whiteheadi instituudi uurimisasutusele. See patent tunnistas, et geneetilist materjali on võimalik ekstraheerida, sidudes need tahke kandjaga, milleks võib olla magnethelmes. Põhimõte seisneb selles, et kasutate kõrge funktsionaalsusega magnethelmeid, mille külge seostub geneetiline materjal, mida saab seejärel supernatandist eraldada, rakendades proovi hoidva anuma välisküljele magnetjõudu.
Miks kasutada magnethelmeste ekstraheerimist?
Magnethelmeste ekstraheerimise tehnoloogia on muutumas üha levinumaks, kuna sellel on potentsiaal kiirete ja tõhusate ekstraheerimisprotseduuride jaoks. Viimastel aegadel on arendatud kõrge funktsionaliseeritud magnethelmeid koos sobivate puhversüsteemidega, mis on võimaldanud automatiseerida nukleiinhapete ekstraheerimist ja töövoogu, mis on ressursis väga kerge ja kulutõhus. Samuti ei hõlma magnethelmeste ekstraheerimismeetodid tsentrifuugimisetappe, mis võivad põhjustada nihkejõude, mis lõhuvad pikemaid DNA tükke. See tähendab, et pikemad DNA ahelad jäävad puutumatuks, mis on genoomikatestimisel oluline.
Postitusaeg: 25.11.2022