Ehkki teoreetiliselt piisab malli ühest molekulist, kasutatakse tavaliselt klassikalise PCR -i jaoks märkimisväärselt suuremaid DNA -sid, näiteks kuni 1 ug genoomset imetaja DNA -d ja nii vähe kui 1 pg plasmiidi DNA -d. Optimaalne kogus sõltub suuresti sihtjärjestuse koopiate arvust, samuti selle keerukusest.
Kui kasutatakse väga vähe malli, on piisava koguse toote saamiseks vaja vastavat amplifikatsioonitsüklite arvu suurenemist. TAQ-polümeraasil, mida kasutatakse enamikus PCR-katsetes, ei ole parandusfunktsiooni (3′-5 'eksonukleaasi aktiivsus); Seega ei saa amplifikatsiooni ajal esinevaid vigu parandada. Mida suurem on tsüklite arv, seda valdavam on vigase toote võimendamine. Kui teisest küljest on malli kogus liiga kõrge, suureneb praimerite lõnus teiste (mitte sada protsenti tasuta) järjestuste, samuti praimeri dimeeride moodustumise tõenäosus, mis põhjustab amplifikatsiooni kõrvalsaadused. Paljudel juhtudel isoleeritakse DNA rakukultuuridest või mikroorganismidest ja seejärel kasutatakse seda PCR -mallina. Pärast puhastamist on vaja määratleda DNA kontsentratsioon, et määratleda PCR -i seadistamiseks vajalik maht. Kuigi agaroosgeeli elektroforees võib hinnangu anda, pole see meetod kaugeltki täpne. Nukleiinhapete kvantifitseerimise kuldstandardina on kindlaks tehtud UV-vis spektrofotomeetria; See otsene ja seetõttu lihtne ja kiire meetod mõõdab proovi neeldumist kiirusel 260 nm ning kontsentratsioon arvutatakse muundusteguri abil.
Kui DNA kontsentratsioon on siiski väga madal, (<1 ug/ml dsDNA) või kui see on saastunud ainetega, mis neelavad ka vahemikus 260 nm (nt RNA, valk, soolad), saavutab see meetod oma piirangud. Väga madala kontsentratsiooni korral muutuvad näidud peagi liiga ebatäpseks, et seda kasutada, ja saasted põhjustavad tegeliku väärtuse (mõnikord tohutut) ülehindamist. Sel juhul võib fluorestsentsi abil kvantifitseerimine olla alternatiiv. See tehnika põhineb fluorestsentsvärvi kasutamisel, mis seostub spetsiaalselt dsDNA -ga ainult nukleiinhapet ja värvainet sisaldava kompleksiga on ergastatud ja see kiirgab seejärel valgust pisut suurema lainepikkusega. Siin on fluorestsentssignaali intensiivsus võrdeline DNA kogusega ja kontsentratsiooni määramiseks hinnatakse seda standardkõvera suhtes. Selle meetodi eelised toetuvad sideme spetsiifilisusele, mis välistab saastumisega kaasnevad välised mõjud, samuti sellest tulenev võime tuvastada DNA väga madalaid kontsentratsioone. Mõlema meetodi sobivus sõltub peamiselt proovi kontsentratsioonist ja puhtusest; Paljudel juhtudel võib olla soovitatav kasutada mõlemat meetodit paralleelselt.
Postiaeg: 30.-30.-2012