Para que las reacciones de amplificación tengan éxito, es necesario que los componentes individuales de la reacción estén presentes en la concentración correcta en cada preparación. Además, es importante que no se produzca contaminación.
Especialmente cuando es necesario preparar muchas reacciones, se ha establecido preparar la llamada mezcla maestra en lugar de pipetear cada reactivo por separado en cada recipiente. Hay mezclas preconfiguradas disponibles comercialmente, en las que solo se añaden componentes específicos de la muestra (imprimación) y agua. Alternativamente, usted mismo puede preparar la mezcla maestra. En ambas variantes, la mezcla se distribuye en cada recipiente de PCR sin plantilla y la muestra de ADN individual se añade por separado al final.
El uso de una mezcla maestra tiene varias ventajas: en primer lugar, se reduce el número de pasos de pipeteo individuales. De esta manera se minimiza tanto el riesgo de errores del usuario durante el pipeteo como el riesgo de contaminación y, por supuesto, se ahorra tiempo. En principio, la precisión del pipeteo también es mayor, ya que se dosifican volúmenes mayores. Esto es fácil de entender cuando se comprueban los datos técnicos de las pipetas: cuanto menor sea el volumen dosificado, mayores pueden ser las desviaciones. El hecho de que todas las preparaciones provengan del mismo recipiente tiene un efecto positivo en la homogeneidad (si están bien mezcladas). Esto también mejora la reproducibilidad de los experimentos.
Al preparar la mezcla maestra, se debe agregar al menos un 10 % de volumen adicional (por ejemplo, si se necesitan 10 preparaciones, calcule sobre la base de 11), para que hasta el último recipiente se llene correctamente. De esta manera se pueden compensar (ligeras) imprecisiones en el pipeteo y el efecto de la pérdida de muestra al dosificar soluciones que contienen detergentes. Los detergentes están contenidos en soluciones enzimáticas como polimerasas y mezclas maestras, lo que provoca la formación de espuma y residuos en la superficie interna de los detergentes normales.puntas de pipeta.
Dependiendo de la aplicación y del tipo de líquido a dosificar, se debe elegir la técnica de pipeteo correcta (1) y seleccionar el equipo adecuado. Para soluciones que contienen detergentes, se recomienda un sistema de desplazamiento directo o las denominadas puntas de pipeta de “baja retención” como alternativa a las pipetas con colchón de aire. El efecto dePunta de pipeta ACEse basa en una superficie particularmente hidrófoba. Los líquidos que contienen detergentes no dejan una película residual en el interior ni en el exterior, por lo que se puede minimizar la pérdida de solución.
Además de la dosificación exacta de todos los componentes, también es importante que no se produzca contaminación de los preparados. No basta con utilizar consumibles de alta pureza, ya que durante el proceso de pipeteo en una pipeta con colchón de aire se pueden producir aerosoles que permanecen en la pipeta. El ADN que pueda estar contenido en el aerosol puede transferirse de una muestra a la siguiente en el siguiente paso de pipeteo y provocar así una contaminación. Los sistemas de desplazamiento directo mencionados anteriormente también pueden minimizar este riesgo. En el caso de las pipetas con colchón de aire, tiene sentido utilizar puntas con filtro para proteger el cono de la pipeta reteniendo salpicaduras, aerosoles y biomoléculas.
Hora de publicación: 06-dic-2022