Para reacciones de amplificación exitosas, es necesario que los componentes de reacción individuales estén presentes en la concentración correcta en cada preparación. Además, es importante que no se produzca contaminación.
Especialmente cuando se deben configurar muchas reacciones, se ha establecido para preparar una llamada mezcla maestra en lugar de pipetear cada reactivo por separado en cada recipiente. Las mezclas preconfiguradas están disponibles comercialmente, en la que solo se agregan componentes específicos de muestra (cebador) y agua. Alternativamente, la mezcla maestra se puede preparar usted mismo. En ambas variantes, la mezcla se distribuye a cada vaso de PCR sin una plantilla y la muestra de ADN individual se agrega por separado al final.
El uso de una mezcla maestra tiene varias ventajas: primero, se reduce el número de pasos de pipeteo individuales. De esta manera, tanto el riesgo de errores del usuario durante la pipetización como el riesgo de contaminación se minimizan y, por supuesto, se ahorra el tiempo. En principio, la precisión de pipeteo también es mayor, ya que se dosifican volúmenes más grandes. Esto es fácil de entender al verificar los datos técnicos de las pipetas: cuanto más pequeño sea el volumen dosificado, mayores serán las desviaciones. El hecho de que todas las preparaciones provengan del mismo recipiente tienen un efecto positivo en la homogeneidad (si están bien mezcladas). Esto también mejora la reproducibilidad de los experimentos.
Al preparar la mezcla maestra, se debe agregar al menos un volumen adicional del 10 % (por ejemplo, si se requieren 10 preparaciones, calcule sobre la base de 11), de modo que incluso el último recipiente se llenó correctamente. De esta manera, (ligeras) inexactitudes de pipeteo, y el efecto de la pérdida de muestra al dosificar las soluciones que contienen detergentes se pueden compensar. Los detergentes están contenidos en soluciones enzimáticas como polimerasas y mezclas maestras, causando formación de espuma y residuos en la superficie interna de la normalidadconsejos de pipeta.
Dependiendo de la aplicación y el tipo de líquido a dispensar, se debe elegir la técnica de pipeteo correcta (1) y el equipo apropiado seleccionado. Para soluciones que contienen detergentes, se recomienda un sistema de desplazamiento directo o las llamadas puntas de pipeta de "baja retención" como alternativa para las pipetas de cojín de aire. El efecto deConsejo de pipeta de asse basa en una superficie particularmente hidrofóbica. Los líquidos que contienen detergentes no dejan una película de residuos en el interior y el exterior, de modo que se pueda minimizar la pérdida de solución.
Además de la dosificación exacta de todos los componentes, también es importante que no se produzca contaminación de las preparaciones. No es suficiente usar consumibles de alta pureza, porque el proceso de pipeteo en una pipeta de cojín de aire puede producir aerosoles que permanecen en la pipeta. El ADN que puede estar contenido en el aerosol se puede transferir de una muestra a la siguiente en el siguiente paso de pipeteo y, por lo tanto, conduce a la contaminación. Los sistemas de desplazamiento directo mencionados anteriormente también pueden minimizar este riesgo. Para las pipetas de cojín de aire, tiene sentido usar puntas de filtro para proteger el cono de pipeta mediante la retención de salpicaduras, aerosoles y biomoléculas.
Tiempo de publicación: Dic-06-2022