criovialesse utilizan comúnmente para el almacenamiento criogénico de líneas celulares y otros materiales biológicos críticos, en recipientes dewar llenos de nitrógeno líquido.

Hay varias etapas involucradas en la preservación exitosa de células en nitrógeno líquido. Si bien el principio básico es una congelación lenta, la técnica exacta empleada depende del tipo de célula y del crioprotector utilizado. Hay varias consideraciones de seguridad y mejores prácticas a tener en cuenta al almacenar celdas a temperaturas tan bajas.

Esta publicación tiene como objetivo brindar una descripción general de cómo se almacenan los crioviales en nitrógeno líquido.

¿Qué son los crioviales?

Los crioviales son viales pequeños con tapa diseñados para almacenar muestras líquidas a temperaturas extremadamente bajas. Garantizan que las células conservadas en crioprotector no entren en contacto directo con el nitrógeno líquido, minimizando el riesgo de fracturas celulares y al mismo tiempo beneficiándose del efecto refrescante extremo del nitrógeno líquido.

Los viales suelen estar disponibles en una variedad de volúmenes y diseños; pueden tener rosca interna o externa y fondos planos o redondeados. También están disponibles formatos estériles y no estériles.

Quien usacirovialesalmacenar células en nitrógeno líquido

Una variedad de laboratorios privados y del NHS, así como instituciones de investigación especializadas en bancos de sangre del cordón umbilical, biología de células epiteliales, inmunología y biología de células madre, utilizan crioviales para criopreservar células.

Las células conservadas de esta manera incluyen células B y T, células CHO, células madre y progenitoras hematopoyéticas, hibridomas, células intestinales, macrófagos, células madre y progenitoras mesenquimales, monocitos, mieloma, células NK y células madre pluripotentes.

Descripción general de cómo almacenar crioviales en nitrógeno líquido

La criopreservación es un proceso que preserva las células y otras construcciones biológicas enfriándolas a temperaturas muy bajas. Las células pueden almacenarse en nitrógeno líquido durante años sin pérdida de viabilidad celular. Este es un resumen de los procedimientos empleados.

Preparación celular

El método exacto para preparar muestras variará según el tipo de célula, pero en general, las células se recolectan y centrifugan para desarrollar un sedimento rico en células. Luego, este sedimento se resuspende en el sobrenadante mezclado con crioprotector o un medio de criopreservación.

Medio de criopreservación

Este medio se emplea para preservar las células en los ambientes de baja temperatura a los que estarán sometidas al inhibir la formación de cristales intra y extracelulares y, por tanto, la muerte celular. Su función es proporcionar un entorno seguro y protector para las células y tejidos durante los procesos de congelación, almacenamiento y descongelación.

Un medio como plasma fresco congelado (PFC), solución de plasmalito heparinizado o soluciones sin suero y sin componentes animales se mezcla con crioprotectores como dimetilsulfóxido (DMSO) o glicerol.

El sedimento de muestra relicuado se divide en alícuotas en crioviales de polipropileno, tales comoViales de almacenamiento criogénico de la empresa Suzhou Ace Biomedical.

Es importante no llenar demasiado los crioviales, ya que esto aumentará el riesgo de agrietamiento y la posible liberación del contenido (1).

Tasa de congelación controlada

En general, se emplea una velocidad de congelación lenta y controlada para la criopreservación exitosa de las células.

Después de dividir las muestras en viales criogénicos, se colocan en hielo húmedo o en un refrigerador a 4 ℃ y se inicia el procedimiento de congelación en 5 minutos. Como guía general, las células se enfrían a una velocidad de -1 a -3 por minuto (2). Esto se logra utilizando un refrigerador programable o colocando los viales en una caja aislada colocada en un congelador de velocidad controlada de –70 °C a –90 °C.

Transferencia a nitrógeno líquido

Luego, los viales criogénicos congelados se transfieren a un tanque de nitrógeno líquido durante períodos indefinidos, siempre que se mantenga una temperatura inferior a -135 ℃.

Estas temperaturas ultrabajas se pueden obtener mediante inmersión en nitrógeno en fase líquida o vapor.

¿Fase líquida o vapor?

Se sabe que el almacenamiento en nitrógeno en fase líquida mantiene la temperatura fría con absoluta consistencia, pero a menudo no se recomienda por las siguientes razones:

• La necesidad de grandes volúmenes (profundidad) de nitrógeno líquido, lo cual es un peligro potencial. Quemaduras o asfixia debido a esto es un riesgo real.
• Casos documentados de contaminación cruzada por agentes infecciosos como aspergillus, hepatitis B y propagación viral a través del medio de nitrógeno líquido (2,3)
• La posibilidad de que el nitrógeno líquido se filtre en los viales durante la inmersión. Cuando se saca del almacenamiento y se calienta a temperatura ambiente, el nitrógeno se expande rápidamente. En consecuencia, el vial puede romperse cuando se retira del almacenamiento de nitrógeno líquido, creando un peligro tanto por los desechos voladores como por la exposición al contenido (1, 4).

Por estas razones, el almacenamiento a temperatura ultrabaja se realiza más comúnmente en nitrógeno en fase de vapor. Cuando las muestras deben almacenarse en fase líquida, se deben utilizar tubos crioflex especializados.

La desventaja de la fase de vapor es que puede ocurrir un gradiente de temperatura vertical que resulta en fluctuaciones de temperatura entre -135 ℃ y -190 ℃. Esto requiere un control cuidadoso y diligente de los niveles de nitrógeno líquido y las variaciones de temperatura (5).

Muchos fabricantes recomiendan que los crioviales sean adecuados para almacenamiento hasta -135 ℃ o para uso únicamente en fase de vapor.

Descongelar sus células criopreservadas

El procedimiento de descongelación es estresante para un cultivo congelado y se requiere una manipulación y una técnica adecuadas para garantizar una viabilidad, recuperación y funcionalidad óptimas de las células. Los protocolos de descongelación exactos dependerán de tipos de células específicos. Sin embargo, la descongelación rápida se considera estándar para:

• Disminuir cualquier impacto en la recuperación celular.
• Ayuda a reducir el tiempo de exposición a los solutos presentes en los medios de congelación.
• Minimizar cualquier daño por recristalización del hielo.

Para descongelar muestras se utilizan comúnmente baños de agua, baños de perlas o instrumentos automatizados especializados.

Con mayor frecuencia, se descongela 1 línea celular a la vez durante 1 a 2 minutos, agitándolas suavemente en un baño de agua a 37 ℃ hasta que quede solo un poco de hielo en el vial antes de lavarlas en un medio de crecimiento precalentado.

Para algunas células, como los embriones de mamíferos, el calentamiento lento es esencial para su supervivencia.

Las células ahora están listas para el cultivo celular, el aislamiento celular o, en el caso de las células madre hematopoyéticas, estudios de viabilidad para garantizar la integridad de las células madre del donante antes de la terapia mieloablativa.

Es una práctica normal tomar pequeñas alícuotas de la muestra prelavada utilizada para realizar un recuento celular para determinar las concentraciones celulares para sembrar en cultivo. Luego podrá evaluar los resultados de los procedimientos de aislamiento celular y determinar la viabilidad celular.

Mejores prácticas para el almacenamiento de crioviales

El éxito de la criopreservación de muestras almacenadas en crioviales depende de muchos elementos del protocolo, incluido el almacenamiento y el mantenimiento de registros adecuados.

• Dividir celdas entre ubicaciones de almacenamiento– Si los volúmenes lo permiten, divida las celdas en viales y guárdelas en lugares separados para reducir el riesgo de pérdida de muestra debido a fallas del equipo.
• Prevenir la contaminación cruzada– Optar por viales criogénicos estériles de un solo uso o autoclave antes de su uso posterior
• Utilice viales del tamaño adecuado para sus células– los viales vienen en una variedad de volúmenes entre 1 y 5 ml. Evite llenar demasiado los viales para reducir el riesgo de grietas.
• Seleccione viales criogénicos con rosca interna o externa– Algunas universidades recomiendan los viales con rosca interna como medida de seguridad; también pueden evitar la contaminación durante el llenado o cuando se almacenan en nitrógeno líquido.
• Prevenir fugas- Utilice sellos biinyectados moldeados en el tapón de rosca o en las juntas tóricas para evitar fugas y contaminación.
• Utilice códigos de barras 2D y etiquete viales– para garantizar la trazabilidad, los viales con grandes áreas de escritura permiten etiquetar adecuadamente cada vial. Los códigos de barras 2D pueden ayudar con la gestión del almacenamiento y el mantenimiento de registros. Las tapas codificadas por colores son útiles para una identificación más sencilla.
• Mantenimiento adecuado del almacenamiento- Para garantizar que no se pierdan células, los recipientes de almacenamiento deben controlar constantemente la temperatura y los niveles de nitrógeno líquido. Se deben instalar alarmas para alertar a los usuarios de errores.

Precauciones de seguridad

El nitrógeno líquido se ha convertido en una práctica común en la investigación moderna, pero conlleva el riesgo de provocar lesiones graves si se utiliza incorrectamente.

Se debe usar equipo de protección personal (PPE) adecuado para minimizar el riesgo de congelación, quemaduras y otros incidentes adversos al manipular nitrógeno líquido. Tener puesto

• guantes criogénicos
• bata de laboratorio
• Protector facial completo resistente a impactos que también cubre el cuello.
• Zapatos cerrados
• Delantal de plástico a prueba de salpicaduras

Los refrigeradores de nitrógeno líquido deben ubicarse en áreas bien ventiladas para minimizar el riesgo de asfixia: el nitrógeno que se escapa se vaporiza y desplaza el oxígeno atmosférico. Las tiendas de gran volumen deben tener sistemas de alarma de bajo nivel de oxígeno.

Lo ideal es trabajar en parejas cuando se manipula nitrógeno líquido y se debe prohibir su uso fuera del horario laboral normal.

Crioviales para respaldar su flujo de trabajo

La empresa Suzhou Ace Biomedical ofrece una amplia selección de productos que satisfacen sus necesidades de criopreservación para diferentes tipos de células. La cartera incluye una gama de tubos, así como una gama de crioviales estériles.

Nuestros crioviales son:

• Tapón de rosca de laboratorio, 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, viales criogénicos crioviales, criotubo de fondo cónico con junta

  ● Especificación de 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, con faldón o sin faldón
  ● Están disponibles diseños cónicos o autónomos, estériles o no estériles.
  ● Los tubos con tapón de rosca están hechos de polipropileno de grado médico.
  ● Los viales de criotubo de PP se pueden congelar y descongelar repetidamente
  ●El diseño de la tapa externa puede reducir la probabilidad de contaminación durante el tratamiento de la muestra.
  ● Tubos criogénicos con tapón de rosca Roscas universales para uso
  ● Los tubos se adaptan a los rotores más comunes.
  ● Los tubos con junta tórica para tubos criogénicos se adaptan a cajas de congelador estándar de 1 y 2 pulgadas, de 48, 81, 96 y 100 pocillos.
  ● Esterilizable en autoclave a 121°C y congelable a -86°C

  NÚMERO DE PARTE	MATERIAL	VOLUMEN	TAPACOLOR	uds/BOLSA	BOLSAS/ESTUCHE
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Negro, Amarillo, Azul, Rojo, Púrpura, Blanco	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Negro, Amarillo, Azul, Rojo, Púrpura, Blanco	500	10
  ACT15-BL-NO	PP	1,5 ml	Negro, Amarillo, Azul, Rojo, Púrpura, Blanco	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Negro, Amarillo, Azul, Rojo, Púrpura, Blanco	500	10