La estandarización de procesos incluye su optimización y posterior establecimiento y armonización, permitiendo un rendimiento óptimo a largo plazo – independientemente del usuario. La estandarización garantiza resultados de alta calidad, así como su reproducibilidad y comparabilidad.
El objetivo de la PCR (clásica) es generar un resultado fiable y reproducible. Para ciertas aplicaciones, el rendimiento delproducto de PCRtambién es relevante. Para estas reacciones, se debe tener cuidado para garantizar que las muestras no se vean comprometidas y que el flujo de trabajo de la PCR permanezca estable. En concreto, esto se traduce en minimizar la introducción de contaminaciones que podrían dar lugar a resultados falsos positivos o falsos negativos o incluso inhibir la reacción de PCR. Además, las condiciones de reacción deben ser lo más idénticas posible para cada muestra individual dentro de una serie y también ser transferibles a reacciones posteriores (del mismo método). Esto se refiere a la composición de las reacciones así como al tipo de control de temperatura en el ciclador. Por supuesto, se deben evitar en la medida de lo posible los errores del usuario.
A continuación, demostraremos los desafíos que se enfrentan durante la preparación y durante la ejecución de una PCR, y los enfoques de las soluciones que existen con respecto a los instrumentos y consumibles utilizados para la estandarización de los flujos de trabajo de la PCR.
Preparación de la reacción
La dispensación de componentes de reacción en recipientes o placas de PCR, respectivamente, comprende múltiples desafíos que deben superarse:
Condiciones de reacción
La dosificación exacta y precisa de los componentes individuales es indispensable para lograr las condiciones de reacción más idénticas posibles. Además de una buena técnica de pipeteo, es fundamental seleccionar la herramienta adecuada. Las mezclas maestras de PCR contienen frecuentemente sustancias que aumentan la viscosidad o generan espuma. Durante el proceso de pipeteo, esto conduce a una humectación sustancial delpuntas de pipeta, reduciendo así la precisión del pipeteo. El uso de sistemas de dispensación directa o puntas de pipeta alternativas que sean menos propensas a mojarse puede mejorar la exactitud y precisión del proceso de pipeteo.
Contaminaciones
Durante el proceso de dispensación, se generan aerosoles que, si se les permite llegar al interior de la pipeta, pueden contaminar potencialmente otra muestra durante el siguiente paso de pipeteo. Esto se puede evitar utilizando puntas de filtro o sistemas de desplazamiento directo.
Consumibles comoconsejos, los recipientes y las placas que se utilizan en el flujo de trabajo de la PCR no deben contener sustancias que comprometan la muestra o falsifiquen el resultado. Estos incluyen ADN, ADNasas, ARNasas e inhibidores de la PCR, así como componentes que potencialmente pueden lixiviarse del material durante la reacción: sustancias conocidas como lixiviables.
error de usuario
Cuantas más muestras se procesen, mayor será el riesgo de error. Puede ocurrir fácilmente que una muestra se pipetee en el recipiente equivocado o en el pocillo equivocado. Este riesgo se puede reducir considerablemente marcando los pozos fácilmente. Mediante la automatización de los pasos de dosificación se minimiza el "factor humano", es decir, los errores y las variaciones relacionadas con el usuario, aumentando así la reproducibilidad, especialmente en el caso de volúmenes de reacción pequeños. Esto requiere placas con suficiente estabilidad dimensional para ser empleadas en una estación de trabajo. Los códigos de barras adjuntos brindan legibilidad mecánica adicional, lo que simplifica el seguimiento de las muestras durante todo el proceso.
Programación del termociclador.
Programar un instrumento puede resultar lento y propenso a errores. Las diferentes características del termociclador de PCR trabajan juntas para simplificar este paso del proceso y, lo más importante, hacerlo seguro:
Un funcionamiento sencillo y una buena guía para el usuario son la base de una programación eficiente. Sobre esta base, la administración de usuarios protegida por contraseña evitará que otros usuarios modifiquen los propios programas. Si se utilizan varios cicladores (del mismo tipo), es beneficioso que un programa se pueda transferir directamente de un instrumento a otro mediante USB o conectividad. El software informático permite la administración central y segura de programas, derechos de usuario y documentos en una computadora.
ejecución de PCR
Durante la ejecución, el ADN se amplifica en el recipiente de reacción, donde cada muestra debe someterse a condiciones de reacción idénticas y consistentes. Los siguientes aspectos son relevantes para el proceso:
control de temperatura
La excelente precisión en el control de la temperatura y la homogeneidad del bloque ciclador son la base para un acondicionamiento de temperatura uniforme de todas las muestras. La alta calidad de los elementos de calefacción y refrigeración (elementos Peltier), así como la forma en que están conectados al bloque, son los factores decisivos que determinarán el riesgo de diferencias de temperatura conocido como “efecto de borde”.
Evaporación
Las concentraciones de los componentes individuales de la reacción no deberían cambiar durante el transcurso de la reacción debido a la evaporación. De lo contrario, es posible que muy pocoproducto de PCRpuede generarse, o ninguno en absoluto. Por lo tanto, es fundamental minimizar la evaporación garantizando un sellado seguro. En este caso, la tapa calentada del termociclador y el sello del recipiente trabajan de la mano. Hay diferentes opciones de sellado disponibles paraPlacas PCR (enlace: Artículo sobre sellado), donde el mejor sellado se logra mediante termosellado. También pueden ser adecuados otros cierres, siempre que la presión de contacto de la tapa del ciclador pueda ajustarse a la junta seleccionada.
Existe una estandarización de procesos para salvaguardar resultados precisos y reproducibles a largo plazo. Esto incluye el mantenimiento regular del equipo para garantizar que esté siempre en buenas condiciones de funcionamiento. Todos los consumibles deben ser de alta calidad constante en todos los lotes producidos y se debe garantizar su disponibilidad confiable.
Hora de publicación: 29-nov-2022