La estandarización de los procesos incluye su optimización y su posterior establecimiento y armonización, lo que permite un rendimiento óptimo a largo plazo, independientemente del usuario. La estandarización garantiza resultados de alta calidad, así como su reproducibilidad y comparabilidad.
El objetivo de la PCR (clásica) es la generación de un resultado confiable y reproducible. Para ciertas aplicaciones, el rendimiento delProducto PCRtambién es relevante. Para estas reacciones, se debe tener cuidado para garantizar que las muestras no sean comprometidas y que el flujo de trabajo de PCR permanezca estable. Específicamente, esto se traduce para minimizar la introducción de contaminaciones que podrían conducir a resultados falsos positivos o falsos negativos o incluso inhibir la reacción de PCR. Además, las condiciones de reacción deben ser lo más idénticas posible para cada muestra individual dentro de una ejecución y también ser transferible a las reacciones posteriores (del mismo método). Esto se refiere a la composición de las reacciones, así como al tipo de control de temperatura en el ciclador. Los errores de usuario, por supuesto, deben evitarse tanto como sea posible.
A continuación, demostraremos los desafíos que se encuentran durante la preparación y durante la ejecución de una PCR, y los enfoques de las soluciones que existen con respecto a los instrumentos y consumibles utilizados para la estandarización de los flujos de trabajo de PCR.
Preparación de reacción
La dispensación de componentes de reacción en los buques de PCR, o placas, respectivamente, comprende múltiples desafíos que deben superarse:
Condiciones de reacción
La dosificación exacta y precisa de los componentes individuales es indispensable cuando apunta a las condiciones de reacción más idénticas posibles. Además de una buena técnica de pipeteo, es fundamental seleccionar la herramienta correcta. Las mezclas maestras de PCR con frecuencia contienen sustancias que aumentan la viscosidad o generan espuma. Durante el proceso de pipetización, estos conducen a una humectación sustancial delconsejos de pipeta, reduciendo así la precisión de pipeteo. El uso de sistemas de dispensación directa o puntas de pipeta alternativas que son menos propensas a la humectación pueden mejorar la precisión y precisión del proceso de pipetización.
Contaminaciones
Durante el proceso de dispensación, se generan aerosoles que, si se deja alcanzar el interior de la pipeta, puede contaminar otra muestra durante el siguiente paso de pipeteo. Esto se puede prevenir utilizando puntas de filtro o sistemas de desplazamiento directo.
Consumibles comoconsejos, los vasos y placas que se utilizan en el flujo de trabajo de PCR no deben contener sustancias que comprometan la muestra o falsifiquen el resultado. Estos incluyen ADN, ADNasas, RNasas e inhibidores de PCR, así como componentes que pueden lixiviar del material durante la reacción, sustancias conocidas como lixiviables.
Error de usuario
Cuantas más muestras se procesen, mayor será el riesgo de error. Puede suceder fácilmente que una muestra se pipeteada en el recipiente incorrecto o el pozo incorrecto. Este riesgo puede reducirse considerablemente mediante el marcado fácilmente discernible de los pozos. A través de la automatización de los pasos de dispensación, se minimizan el "factor humano", es decir, los errores y las variaciones relacionadas con el usuario, aumentando así la reproducibilidad, especialmente en el caso de pequeños volúmenes de reacción. Esto requiere placas de estabilidad dimensional suficiente para emplear en una estación de trabajo. Los códigos de barras adjuntos proporcionan una lectura de máquina adicional, que simplifica el seguimiento de muestras en todo el proceso.
Programación del termociclador
La programación de un instrumento puede demostrar que es lento y propenso a errores. Diferentes características de PCR Termal Cycler trabajan juntas para simplificar este paso de proceso y, lo más importante, para que sea seguro:
La operación fácil y la buena guía del usuario son la base de una programación eficiente. Sobre la base de esta base, la administración de usuarios protegida con contraseña evitará que los propios programas sean alterados por otros usuarios. Si se usan varios cicladores (del mismo tipo), es beneficioso si un programa puede transferirse directamente de un instrumento a otro a través de USB o conectividad. El software de la computadora permite la administración central y segura de programas, derechos de usuario y documentos en una computadora.
PCR Run
Durante la ejecución, el ADN se amplifica en el vaso de reacción, donde cada muestra debe someterse a condiciones de reacción idénticas y consistentes. Los siguientes aspectos son relevantes para el proceso:
Control de temperatura
Excelente precisión en el control de la temperatura y la homogeneidad del bloque Cycler son la base del acondicionamiento de temperatura uniforme de todas las muestras. La alta calidad de los elementos de calefacción y enfriamiento (elementos Peltier), así como la forma en que están conectados al bloque, son los factores decisivos que determinarán el riesgo de discrepancias de temperatura conocidas como el "efecto de borde"
Evaporación
Las concentraciones de los componentes de reacción individuales no deben cambiar en el transcurso de la reacción debido a la evaporación. De lo contrario, es posible que muy pocoProducto PCRpuede generarse, o ninguno en absoluto. Por lo tanto, es crucial minimizar la evaporación asegurando un sello seguro. En este caso, la tapa calentada del termociclador y el sello del recipiente trabajan de la mano. Hay diferentes opciones de sellado disponibles paraPlacas de PCR (enlace: artículo de sellado), mediante el cual se logra el mejor sello a través del sellado de calor. Otros cierres también pueden ser adecuados, siempre que la presión de contacto de la tapa del ciclador pueda ajustarse al sello seleccionado.
La estandarización del proceso está vigente para salvaguardar los resultados precisos y reproducibles a largo plazo. Esto incluye el mantenimiento regular del equipo para garantizar que siempre esté en buenas condiciones de trabajo. Todos los consumibles deben ser de alta calidad en todos los lotes producidos, y su disponibilidad confiable debe estar garantizada.
Tiempo de publicación: Nov-29-2022