Aunque en teoría, una molécula de la plantilla sería suficiente, cantidades considerablemente mayores de ADN se usan típicamente para una PCR clásica, por ejemplo, hasta 1 µg de ADN de mamíferos genómicos y tan poco como 1 pg de ADN plasmídico. La cantidad óptima depende en gran medida del número de copias de la secuencia objetivo, así como de su complejidad.
Si se usa muy poca plantilla, se necesitará un aumento correspondiente en el número de ciclos de amplificación para obtener una cantidad suficiente de producto. Una polimerasa Taq que se usa para la mayoría de los experimentos de PCR no presenta una función de corrección (actividad de exonucleasa 3'-5 '); Por lo tanto, los errores que ocurren durante la amplificación no se pueden corregir. Cuanto mayor sea el número de ciclos, más prevalente será la amplificación del producto defectuoso. Si, por otro lado, la cantidad de plantilla es demasiado alta, la probabilidad de que los cebadores se recocieran a otras secuencias (no cien por ciento complementarias), así como la formación de dímeros de cebadores, lo que dará como resultado la amplificación de subproductos. En muchos casos, el ADN se aísla de cultivos celulares o de microorganismos y posteriormente se utiliza como plantilla de PCR. Después de la purificación, es necesario determinar la concentración del ADN para poder definir el volumen que se requiere para la configuración de PCR. Si bien la electroforesis en gel de agarosa puede servir para proporcionar una estimación, este método está lejos de ser preciso. La espectrofotometría UV-vis se ha establecido como el estándar de oro para la cuantificación de ácidos nucleicos; Este método directo y, por lo tanto, fácil y rápido, mide la absorbancia de la muestra a 260 nm, y la concentración se calcula con la ayuda de un factor de conversión.
Sin embargo, si la concentración de ADN es muy baja (<1 µg/ml de dsDNA), o si está contaminada con sustancias que también absorben en el rango de 260 nm (p. Ej., ARN, proteínas, sales), este método alcanzará sus limitaciones. En el caso de concentraciones muy bajas, las lecturas pronto serán demasiado inexactas para ser útiles, y las contaminaciones conducirán a una sobreestimación (a veces enorme) del valor real. En este caso, la cuantificación utilizando fluorescencia puede presentar una alternativa. Esta técnica se basa en el uso de un tinte fluorescente que se une específicamente al dsDNA, solo el complejo que comprende el ácido y el tinte nucleico se excita por la luz, y posteriormente emitirá luz de una longitud de onda ligeramente más alta. Aquí, la intensidad de la señal fluorescente es proporcional a la cantidad de ADN, y para determinar la concentración se evalúa en relación con una curva estándar. Las ventajas de este método descansan en la especificidad del enlace, lo que excluye las influencias externas introducidas por la contaminación, así como en la capacidad resultante para detectar concentraciones muy bajas de ADN. La idoneidad de cualquier método depende principalmente de la concentración y pureza de la muestra; En muchos casos, incluso puede ser aconsejable aplicar ambos métodos en paralelo.
Tiempo de publicación: Nov-30-2022