Aunque en teoría una molécula del molde sería suficiente, normalmente se utilizan cantidades de ADN considerablemente mayores para una PCR clásica, por ejemplo, hasta 1 µg de ADN genómico de mamífero y tan solo 1 pg de ADN plasmídico. La cantidad óptima depende en gran medida del número de copias de la secuencia objetivo, así como de su complejidad.
Si se utiliza muy poca plantilla, será necesario un aumento correspondiente en el número de ciclos de amplificación para obtener una cantidad suficiente de producto. Una Taq polimerasa que se utiliza para la mayoría de los experimentos de PCR no presenta una función de corrección (actividad exonucleasa 3′-5′); por tanto, los errores que se producen durante la amplificación no se pueden corregir. Cuanto mayor sea el número de ciclos, más frecuente será la amplificación del producto defectuoso. Si, por otro lado, la cantidad de plantilla es demasiado alta, aumentará la probabilidad de que los cebadores se hibriden con otras secuencias (no cien por ciento complementarias), así como la formación de dímeros de cebadores, lo que dará como resultado la amplificación de subproductos. En muchos casos, el ADN se aísla de cultivos celulares o de microorganismos y posteriormente se utiliza como plantilla de PCR. Después de la purificación, es necesario determinar la concentración de ADN para poder definir el volumen necesario para la configuración de la PCR. Si bien la electroforesis en gel de agarosa puede servir para proporcionar una estimación, este método está lejos de ser exacto. La espectrofotometría UV-Vis se ha establecido como el estándar de oro para la cuantificación de ácidos nucleicos; Este método directo y, por tanto, fácil y rápido mide la absorbancia de la muestra a 260 nm y la concentración se calcula con la ayuda de un factor de conversión.
Sin embargo, si la concentración de ADN es muy baja (< 1 µg/ml de ADNds), o si está contaminada con sustancias que también se absorben en el rango de 260 nm (p. ej., ARN, proteínas, sales), este método alcanzará sus limitaciones. En el caso de concentraciones muy bajas, las lecturas pronto se volverán demasiado inexactas para ser útiles y las contaminaciones conducirán a una sobreestimación (a veces enorme) del valor real. En este caso, la cuantificación mediante fluorescencia puede presentar una alternativa. Esta técnica se basa en el uso de un tinte fluorescente que se une específicamente al ADNds, solo el complejo que comprende ácido nucleico y tinte es excitado por la luz y posteriormente emitirá luz de una longitud de onda ligeramente mayor. En este caso, la intensidad de la señal fluorescente es proporcional a la cantidad de ADN y para determinar la concentración se evalúa en relación con una curva estándar. Las ventajas de este método residen en la especificidad del enlace, que excluye las influencias externas introducidas por la contaminación, así como en la capacidad resultante para detectar concentraciones muy bajas de ADN. La idoneidad de cualquiera de los métodos depende principalmente de la concentración y pureza de la muestra; en muchos casos puede incluso ser aconsejable aplicar ambos métodos en paralelo.
Hora de publicación: 30-nov-2022