Enkonduko
Kio estas eltiro de nuklea acido?
En la plej simplaj terminoj, nuklea acida eltiro estas la forigo de la RNA kaj/aŭ DNA el specimeno kaj la tuta troo, kiu ne necesas. La procezo de eltiro izolas la nukleajn acidojn de specimeno kaj donas ilin en formo de koncentrita eluato, libera de diluantoj kaj poluantoj, kiuj povus influi iujn ajn malsuprenirajn aplikojn.
Aplikoj de eltiro de nuklea acido
Purigitaj nukleaj acidoj estas uzataj en multego de malsamaj aplikoj, tra multnombraj industrioj. Kuracado estas eble la areo, kie ĝi estas plej uzata, kun purigita RNA kaj DNA bezonata por amaso da malsamaj el malsamaj provaj celoj.
Aplikoj de nuklea acida eltiro en sanservo inkluzivas:
- Sekva Generacio -Sekvenco (NGS)
- Amplifig-bazita SNP-genotipado
- Array-bazita genotipado
- Restrikta enzima digesto
- Analizoj uzante modifajn enzimojn (ekz. Ligado kaj klonado)
Ekzistas ankaŭ aliaj kampoj preter sanservo, kie estas uzata nuklea acida eltiro, inkluzive de sed ne limigita al patreca testado, kuracistoj kaj genomiko.
Mallonga historio de eltiro de nuklea acido
Eltiro de DNADatoj multe da vojo, kun la unua konata izolado farita de svisa kuracisto nomata Friedrich Miescher en 1869. Miescher esperis solvi la fundamentajn principojn de vivo per determinado de la kemia konsisto de ĉeloj. Post malsukcesado de limfocitoj, li povis akiri krudan precipitaĵon de DNA de leŭkocitoj trovitaj en PUS sur forĵetitaj bandaĝoj. Li faris tion aldonante acidon kaj poste alkali al la ĉelo por lasi la citoplasmon de la ĉelo, kaj poste disvolvis protokolon por apartigi la DNA de la aliaj proteinoj.
Post la grunda esplorado de Miescher, multaj aliaj sciencistoj daŭriĝis por progresi kaj disvolvi teknikojn por izoli kaj purigi DNA. Edwin Joseph Cohn, proteina sciencisto disvolvis multajn teknikojn por purigado de proteinoj dum 2 -a Mondmilito. Li respondecis pri izolado de la seruma albumina frakcio de sanga plasmo, kio gravas por konservi la osmotan premon en la sangaj glasoj. Ĉi tio estis kerna por vivteni soldatojn.
En 1953 Francis Crick, kune kun Rosalind Franklin kaj James Watson, determinis la strukturon de DNA, montrante, ke ĝi estas formita de du ŝnuroj de longaj ĉenoj de nukleaj acidaj nukleotidoj. Ĉi tiu eltrova malkovro malfermis la vojon al Meselson kaj Stahl, kiuj povis disvolvi protokolon de centrifuga denseco por izoli DNA de E. coli-bakterioj dum ili pruvis la duon-konservativan replikadon de DNA dum sia eksperimento de 1958.
Teknikoj de eltiro de nuklea acido
Kio estas la 4 stadioj de eltiro de DNA?
Ĉiuj eltiraj metodoj kreskas ĝis la samaj fundamentaj paŝoj.
Ĉela interrompo. Ĉi tiu etapo, ankaŭ konata kiel ĉela lizo, implikas detrui la ĉelan muron kaj/aŭ la ĉelan membranon, por liberigi la intraĉelajn fluidojn enhavantajn la nukleajn acidojn de intereso.
Forigo de nedezirataj forĵetaĵoj. Ĉi tio inkluzivas membranajn lipidojn, proteinojn kaj aliajn nedeziratajn nukleajn acidojn, kiuj povas intermiksiĝi en malsuprenfluaj aplikoj.
Izolo. Estas kelkaj diversaj manieroj izoli la nukleajn acidojn de intereso de la malplenigita lisato, kiun vi kreis, kiu estas inter du ĉefaj kategorioj: solva bazita aŭ solida stato (vidu la sekvan sekcion).
Koncentriĝo. Post kiam la nukleaj acidoj estis izolitaj de ĉiuj aliaj poluantoj kaj diluantoj, ili estas prezentitaj en tre koncentrita eluato.
La du specoj de eltiro
Ekzistas du specoj de nuklea acida eltiro - solv -bazitaj metodoj kaj solidaj metodoj. La solva bazita metodo ankaŭ estas konata kiel la kemia eltira metodo, ĉar ĝi implikas uzi kemiaĵojn por detrui la ĉelon kaj aliri la nuklean materialon. Ĉi tio povas uzi aŭ organikajn komponaĵojn kiel fenolo kaj kloroformo, aŭ la malpli malutilaj kaj tial pli rekomendindaj neorganikaj komponaĵoj kiel proteinase K aŭ silika ĝelo.
Ekzemploj de malsamaj kemiaj eltiraj metodoj por detrui ĉelon inkluzivas:
- Osmotika rompado de membrano
- Enzimata digesto de ĉela muro
- solubilizado de membrano
- Kun detergentoj
- Kun alkala kuracado
Solid -stataj teknikoj, ankaŭ konataj kiel mekanikaj metodoj, implikas ekspluatadon kiel DNA interagas kun solida substrato. Elektante bidon aŭ molekulon, kiun la DNA ligos, sed la analito ne, eblas disigi la du. Ekzemploj de solid-fazaj eltiraj teknikoj inkluzive de uzado de siliko kaj magnetaj bidoj.
Magneta eltiro de bidoj klarigis
La magneta eltira metodo
La potencialo por eltiro uzanta magnetajn bidojn unue estis rekonita en usona patento prezentita de Trevor Hawkins, por la Whitehead Institute -Esplorinstitucio. Ĉi tiu patento agnoskis, ke eblas ĉerpi genetikan materialon ligante ilin al solida subtena portanto, kiu povus esti magneta bido. La principo estas, ke vi uzas tre funkciigitan magnetan bidon sur kiun la genetika materialo ligos, kiu tiam povas esti apartigita de la supernatanto per aplikado de magneta forto al la ekstero de la ŝipo tenanta la specimenon.
Kial uzi magnetan bidon -eltiron?
Magneta bido -eltira teknologio fariĝas ĉiam pli ĝenerala, pro la potencialo, kiun ĝi tenas por rapidaj kaj efikaj eltiraj proceduroj. Lastatempe aperis evoluoj de tre funkciigitaj magnetaj bidoj kun taŭgaj bufraj sistemoj, kiuj ebligis aŭtomatigon de nuklea acida eltiro kaj fluo de laboro, kiu estas tre rimeda lumo kaj kosto-efika. Ankaŭ, magnetaj eltiraj metodoj ne implikas la centrifugajn paŝojn, kiuj povas kaŭzi tondajn fortojn, kiuj rompas pli longajn pecojn de DNA. Ĉi tio signifas, ke pli longaj ŝnuroj de DNA restas sendifektaj, kio gravas en testado de genomiko.
Afiŝotempo: Nov-25-2022