Για επιτυχείς αντιδράσεις ενίσχυσης, είναι απαραίτητο τα επιμέρους συστατικά της αντίδρασης να υπάρχουν στη σωστή συγκέντρωση σε κάθε παρασκεύασμα. Επιπλέον, είναι σημαντικό να μην υπάρχει μόλυνση.
Ειδικά όταν πρέπει να δημιουργηθούν πολλές αντιδράσεις, έχει καθιερωθεί η παρασκευή ενός αποκαλούμενου κύριου μείγματος αντί να διοχετεύεται κάθε αντιδραστήριο χωριστά σε κάθε δοχείο. Στο εμπόριο διατίθενται προ-διαμορφωμένα μείγματα, στα οποία προστίθενται μόνο συστατικά ειδικά για δείγματα (primer) και νερό. Εναλλακτικά, το κύριο μείγμα μπορεί να παρασκευαστεί μόνοι σας. Και στις δύο παραλλαγές, το μείγμα κατανέμεται σε κάθε δοχείο PCR χωρίς εκμαγείο και το μεμονωμένο δείγμα DNA προστίθεται ξεχωριστά στο τέλος.
Η χρήση ενός κύριου μείγματος έχει πολλά πλεονεκτήματα: Πρώτον, μειώνεται ο αριθμός των μεμονωμένων βημάτων με πιπέτα. Με αυτόν τον τρόπο, ελαχιστοποιείται τόσο ο κίνδυνος σφαλμάτων χρήστη κατά τη μεταφορά με πιπέτα όσο και ο κίνδυνος μόλυνσης και, φυσικά, εξοικονομείται χρόνος. Κατ' αρχήν, η ακρίβεια της πιπέτας είναι επίσης υψηλότερη, αφού δοσομετρούνται μεγαλύτεροι όγκοι. Αυτό είναι εύκολο να γίνει κατανοητό κατά τον έλεγχο των τεχνικών δεδομένων των πιπετών: Όσο μικρότερος είναι ο όγκος της δόσης, τόσο μεγαλύτερες μπορεί να είναι οι αποκλίσεις. Το γεγονός ότι όλα τα παρασκευάσματα προέρχονται από το ίδιο δοχείο έχει θετική επίδραση στην ομοιογένεια (αν αναμειχθούν καλά). Αυτό βελτιώνει επίσης την αναπαραγωγιμότητα των πειραμάτων.
Κατά την προετοιμασία του κύριου μείγματος, θα πρέπει να προστεθεί τουλάχιστον 10 % επιπλέον όγκος (π.χ. εάν απαιτούνται 10 παρασκευάσματα, υπολογίστε με βάση το 11), ώστε ακόμη και το τελευταίο δοχείο να γεμίσει σωστά. Με αυτόν τον τρόπο, μπορούν να αντισταθμιστούν οι (ελαφρές) ανακρίβειες στο σιφώνιο και η επίδραση της απώλειας δείγματος κατά τη δοσολογία διαλυμάτων που περιέχουν απορρυπαντικό. Τα απορρυπαντικά περιέχονται σε διαλύματα ενζύμων όπως πολυμεράσες και κύρια μείγματα, προκαλώντας σχηματισμό αφρού και υπολείμματα στην εσωτερική επιφάνεια του κανονικούάκρες πιπέτας.
Ανάλογα με την εφαρμογή και τον τύπο του υγρού που θα διανεμηθεί, θα πρέπει να επιλεγεί η σωστή τεχνική εκτόξευσης με πιπέτα (1) και να επιλεγεί ο κατάλληλος εξοπλισμός. Για διαλύματα που περιέχουν απορρυπαντικά, συνιστάται ένα σύστημα άμεσης μετατόπισης ή τα λεγόμενα ρύγχη πιπέτας «χαμηλής συγκράτησης» ως εναλλακτική λύση για τις πιπέτες με μαξιλάρι αέρα. Η επίδραση τουΜύτη ACE PIPETTEβασίζεται σε μια ιδιαίτερα υδρόφοβη επιφάνεια. Τα υγρά που περιέχουν απορρυπαντικά δεν αφήνουν υπολείμματα μεμβράνης εσωτερικά και εξωτερικά, έτσι ώστε να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια διαλύματος.
Εκτός από την ακριβή δοσολογία όλων των συστατικών, είναι επίσης σημαντικό να μην υπάρχει μόλυνση των παρασκευασμάτων. Δεν αρκεί η χρήση αναλώσιμων υψηλής καθαρότητας, επειδή η διαδικασία της μεταφοράς με πιπέτα σε μια πιπέτα με μαξιλάρι αέρα μπορεί να παράγει αερολύματα που παραμένουν στην πιπέτα. Το DNA που μπορεί να περιέχεται στο αεροζόλ μπορεί να μεταφερθεί από το ένα δείγμα στο άλλο στο επόμενο βήμα με πιπέτα και έτσι να οδηγήσει σε μόλυνση. Τα συστήματα άμεσης μετατόπισης που αναφέρονται παραπάνω μπορούν επίσης να ελαχιστοποιήσουν αυτόν τον κίνδυνο. Για τις πιπέτες με μαξιλάρι αέρα, είναι λογικό να χρησιμοποιείτε άκρες φίλτρου για την προστασία του κώνου της πιπέτας συγκρατώντας πιτσιλιές, αερολύματα και βιομόρια.
Ώρα δημοσίευσης: Δεκ-06-2022