Cryovialsχρησιμοποιούνται συνήθως για την κρυογονική αποθήκευση κυτταρικών γραμμών και άλλων κρίσιμων βιολογικών υλικών, σε dewars γεμάτους με υγρό άζωτο.

Υπάρχουν πολλά στάδια που εμπλέκονται στην επιτυχή διατήρηση των κυττάρων σε υγρό άζωτο. Ενώ η βασική αρχή είναι η αργή κατάψυξη, η ακριβής τεχνική που χρησιμοποιείται εξαρτάται από τον τύπο κυττάρου και το κρυοπροστατευτικό που χρησιμοποιείται. Υπάρχουν πολλά ζητήματα ασφάλειας και βέλτιστες πρακτικές που πρέπει να ληφθούν υπόψη κατά την αποθήκευση κυψελών σε τόσο χαμηλές θερμοκρασίες.

Αυτή η ανάρτηση στοχεύει να δώσει μια επισκόπηση του τρόπου με τον οποίο τα κρυοφιαλίδια αποθηκεύονται σε υγρό άζωτο.

Τι είναι τα Cryovials

Τα Cryovials είναι μικρά, καλυμμένα φιαλίδια σχεδιασμένα για αποθήκευση υγρών δειγμάτων σε εξαιρετικά χαμηλές θερμοκρασίες. Διασφαλίζουν ότι τα κύτταρα που διατηρούνται σε κρυοπροστατευτικό δεν έρχονται σε άμεση επαφή με το υγρό άζωτο, ελαχιστοποιώντας τον κίνδυνο κυτταρικών καταγμάτων, ενώ παράλληλα επωφελούνται από την ακραία ψυκτική επίδραση του υγρού αζώτου.

Τα φιαλίδια είναι συνήθως διαθέσιμα σε μια σειρά όγκων και σχεδίων – μπορούν να είναι εσωτερικά ή εξωτερικά με σπείρωμα με επίπεδο ή στρογγυλεμένο πάτο. Διατίθενται επίσης στείρα και μη αποστειρωμένα σχήματα.

Ποιος χρησιμοποιείCyrovialsγια αποθήκευση κυττάρων σε υγρό άζωτο

Μια σειρά από NHS και ιδιωτικά εργαστήρια, καθώς και ερευνητικά ιδρύματα που ειδικεύονται στην τράπεζα αίματος ομφάλιου λώρου, τη βιολογία των επιθηλιακών κυττάρων, την ανοσολογία και τη βιολογία βλαστοκυττάρων χρησιμοποιούν κρυοφιαλίδια για την κρυοσυντήρηση των κυττάρων.

Τα κύτταρα που διατηρούνται με αυτόν τον τρόπο περιλαμβάνουν Β και Τ κύτταρα, CHO κύτταρα, αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα και προγονικά κύτταρα, υβριδώματα, εντερικά κύτταρα, μακροφάγα, μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα και προγονικά κύτταρα, μονοκύτταρα, μυέλωμα, NK κύτταρα και πολυδύναμα βλαστοκύτταρα.

Επισκόπηση του τρόπου αποθήκευσης κρυοφιαλιδίων σε υγρό άζωτο

Η κρυοσυντήρηση είναι μια διαδικασία που διατηρεί τα κύτταρα και άλλα βιολογικά κατασκευάσματα ψύχοντάς τα σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες. Τα κύτταρα μπορούν να αποθηκευτούν σε υγρό άζωτο για χρόνια χωρίς απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων. Αυτή είναι μια περίληψη των διαδικασιών που εφαρμόζονται.

Παρασκευή κυττάρων

Η ακριβής μέθοδος παρασκευής δειγμάτων θα ποικίλλει ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου, αλλά γενικά, τα κύτταρα συλλέγονται και φυγοκεντρούνται για να αναπτυχθεί ένα σφαιρίδιο πλούσιο σε κύτταρα. Αυτό το ίζημα στη συνέχεια επαναιωρείται στο υπερκείμενο αναμεμιγμένο με κρυοπροστατευτικό ή ένα μέσο κρυοσυντήρησης.

Μέσο κρυοσυντήρησης

Αυτό το μέσο χρησιμοποιείται για τη διατήρηση των κυττάρων στα περιβάλλοντα χαμηλής θερμοκρασίας στα οποία θα υποβληθούν αναστέλλοντας τον σχηματισμό ενδο και εξωκυτταρικών κρυστάλλων και ως εκ τούτου τον κυτταρικό θάνατο. Ο ρόλος τους είναι να παρέχουν ένα ασφαλές, προστατευτικό περιβάλλον για τα κύτταρα και τους ιστούς κατά τις διαδικασίες κατάψυξης, αποθήκευσης και απόψυξης.

Ένα μέσο όπως φρέσκο ​​κατεψυγμένο πλάσμα (FFP), διάλυμα ηπαρινισμένου πλασμαλύτη ή διαλύματα χωρίς ορό, χωρίς ζωικά συστατικά αναμιγνύεται με κρυοπροστατευτικά όπως διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ή γλυκερόλη.

Το εκ νέου υγροποιημένο ίζημα δείγματος κατανέμεται σε κρυοφιαλίδια πολυπροπυλενίου όπως π.χSuzhou Ace Βιοϊατρική εταιρεία Cryogenic Storage Vials.

Είναι σημαντικό να μην γεμίζετε υπερβολικά τα κρυοφιαλίδια καθώς αυτό θα αυξήσει τον κίνδυνο ραγίσματος και την πιθανή απελευθέρωση του περιεχομένου (1).

Ελεγχόμενος ρυθμός παγώματος

Γενικά, χρησιμοποιείται ένας αργός ελεγχόμενος ρυθμός κατάψυξης για την επιτυχή κρυοσυντήρηση των κυττάρων.

Αφού τα δείγματα κατανεμηθούν σε κρυογονικά φιαλίδια, τοποθετούνται σε υγρό πάγο ή σε ψυγείο 4℃ και η διαδικασία κατάψυξης ξεκινά εντός 5 λεπτών. Ως γενικός οδηγός, τα κύτταρα ψύχονται με ρυθμό -1 έως -3 ανά λεπτό (2). Αυτό επιτυγχάνεται με τη χρήση ενός προγραμματιζόμενου ψύκτη ή με την τοποθέτηση φιαλιδίων σε ένα μονωμένο κουτί τοποθετημένο σε καταψύκτη ελεγχόμενου ρυθμού -70°C έως -90°C.

Μεταφορά σε υγρό άζωτο

Τα κατεψυγμένα κρυογονικά φιαλίδια στη συνέχεια μεταφέρονται σε δεξαμενή υγρού αζώτου για αόριστες περιόδους, υπό την προϋπόθεση ότι διατηρείται θερμοκρασία μικρότερη από -135℃.

Αυτές οι εξαιρετικά χαμηλές θερμοκρασίες μπορούν να επιτευχθούν με εμβάπτιση στο άζωτο υγρής ή αέριας φάσης.

Φάση υγρού ή ατμού;

Η αποθήκευση σε άζωτο υγρής φάσης είναι γνωστό ότι διατηρεί την ψυχρή θερμοκρασία με απόλυτη συνέπεια, αλλά συχνά δεν συνιστάται για τους ακόλουθους λόγους:

• Η ανάγκη για μεγάλους όγκους (βάθος) υγρού αζώτου που αποτελεί δυνητικό κίνδυνο. Τα εγκαύματα ή η ασφυξία εξαιτίας αυτού είναι πραγματικός κίνδυνος.
• Τεκμηριωμένες περιπτώσεις διασταυρούμενης μόλυνσης από λοιμογόνους παράγοντες όπως ο ασπέργιλλος, η ηπατική Β και η εξάπλωση του ιού μέσω του υγρού αζώτου (2,3)
• Η πιθανότητα διαρροής υγρού αζώτου στα φιαλίδια κατά τη διάρκεια της εμβάπτισης. Όταν αφαιρεθεί από την αποθήκευση και θερμανθεί σε θερμοκρασία δωματίου, το άζωτο διαστέλλεται γρήγορα. Κατά συνέπεια, το φιαλίδιο μπορεί να σπάσει όταν αφαιρεθεί από την αποθήκευση υγρού αζώτου, δημιουργώντας κίνδυνο τόσο από τα ιπτάμενα υπολείμματα όσο και από την έκθεση στο περιεχόμενο (1, 4).

Για αυτούς τους λόγους, η αποθήκευση σε εξαιρετικά χαμηλές θερμοκρασίες γίνεται συνήθως σε άζωτο φάσης ατμού. Όταν τα δείγματα πρέπει να αποθηκευτούν στην υγρή φάση, θα πρέπει να χρησιμοποιείται εξειδικευμένη σωλήνωση cryoflex.

Το μειονέκτημα της φάσης ατμού είναι ότι μπορεί να συμβεί μια κατακόρυφη κλίση θερμοκρασίας με αποτέλεσμα διακυμάνσεις θερμοκρασίας μεταξύ -135℃ και -190℃. Αυτό απαιτεί προσεκτική και επιμελή παρακολούθηση των επιπέδων υγρού αζώτου και των διακυμάνσεων της θερμοκρασίας (5).

Πολλοί κατασκευαστές συνιστούν ότι τα κρυοφιαλίδια είναι κατάλληλα για αποθήκευση έως -135℃ ή για χρήση μόνο στη φάση ατμού.

Απόψυξη των κρυοσυντηρημένων κυττάρων σας

Η διαδικασία απόψυξης είναι αγχωτική για μια κατεψυγμένη καλλιέργεια και απαιτείται σωστός χειρισμός και τεχνική για να εξασφαλιστεί η βέλτιστη βιωσιμότητα, ανάκτηση και λειτουργικότητα των κυττάρων. Τα ακριβή πρωτόκολλα απόψυξης θα εξαρτηθούν από συγκεκριμένους τύπους κυττάρων. Ωστόσο, η ταχεία απόψυξη θεωρείται τυπική για:

• Μειώστε τυχόν επιπτώσεις στην κυτταρική ανάκτηση
• Βοηθήστε στη μείωση του χρόνου έκθεσης στις διαλυμένες ουσίες που υπάρχουν στα μέσα κατάψυξης
• Ελαχιστοποιήστε τυχόν ζημιές από ανακρυστάλλωση πάγου

Για την απόψυξη δειγμάτων χρησιμοποιούνται συνήθως υδατόλουτρα, λουτρά σφαιριδίων ή εξειδικευμένα αυτοματοποιημένα όργανα.

Τις περισσότερες φορές 1 κυτταρική σειρά αποψύχεται κάθε φορά για 1-2 λεπτά, περιστρέφοντας απαλά σε ένα λουτρό νερού 37 ℃ μέχρι να μείνει μόνο ένα μικρό κομμάτι πάγου στο φιαλίδιο προτού πλυθούν σε προθερμασμένο μέσο ανάπτυξης.

Για ορισμένα κύτταρα, όπως τα έμβρυα θηλαστικών, η αργή θέρμανση είναι απαραίτητη για την επιβίωσή τους.

Τα κύτταρα είναι τώρα έτοιμα για κυτταροκαλλιέργεια, απομόνωση κυττάρων ή στην περίπτωση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων – μελέτες βιωσιμότητας για την εγγύηση της ακεραιότητας των βλαστικών κυττάρων-δότη πριν από τη μυελοεκκαθαριστική θεραπεία.

Είναι φυσιολογική πρακτική να λαμβάνονται μικρά δείγματα από το προπλυμένο δείγμα που χρησιμοποιείται για την εκτέλεση μέτρησης κυττάρων για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων κυττάρων για επιμετάλλωση σε καλλιέργεια. Στη συνέχεια, μπορείτε να αξιολογήσετε τα αποτελέσματα των διαδικασιών απομόνωσης κυττάρων και να προσδιορίσετε τη βιωσιμότητα των κυττάρων.

Βέλτιστες πρακτικές για την αποθήκευση κρυοφιαλιδίων

Η επιτυχής κρυοσυντήρηση των δειγμάτων που αποθηκεύονται σε κρυοφιαλίδια εξαρτάται από πολλά στοιχεία του πρωτοκόλλου, συμπεριλαμβανομένης της κατάλληλης αποθήκευσης και τήρησης αρχείων.

• Διαχωρίστε τα κελιά μεταξύ των τοποθεσιών αποθήκευσης– Εάν το επιτρέπουν οι όγκοι, χωρίστε τα κύτταρα μεταξύ φιαλιδίων και αποθηκεύστε τα σε ξεχωριστές θέσεις για να μειώσετε τον κίνδυνο απώλειας δείγματος λόγω αστοχιών του εξοπλισμού.
• Αποτρέψτε τη διασταυρούμενη μόλυνση– Επιλέξτε αποστειρωμένα κρυογονικά φιαλίδια μίας χρήσης ή σε αυτόκλειστο πριν από την επόμενη χρήση
• Χρησιμοποιήστε φιαλίδια κατάλληλου μεγέθους για τα κύτταρα σας– τα φιαλίδια διατίθενται σε μια σειρά όγκων μεταξύ 1 και 5 ml. Αποφύγετε την υπερβολική πλήρωση φιαλιδίων για να μειώσετε τον κίνδυνο ρωγμών.
• Επιλέξτε κρυογονικά φιαλίδια εσωτερικά ή εξωτερικά σπειρώματα– Τα φιαλίδια με εσωτερικό σπείρωμα συνιστώνται από ορισμένα πανεπιστήμια για μέτρα ασφαλείας – μπορούν επίσης να αποτρέψουν τη μόλυνση κατά την πλήρωση ή όταν αποθηκεύονται στο υγρό άζωτο.
• Αποτρέψτε τη διαρροή- Χρησιμοποιήστε στεγανοποιήσεις διπλής έγχυσης διαμορφωμένες στο βιδωτό πώμα ή τους δακτυλίους Ο για να αποτρέψετε τη διαρροή και τη μόλυνση.
• Χρησιμοποιήστε 2D γραμμωτούς κώδικες και φιαλίδια ετικετών– Για να διασφαλιστεί η ιχνηλασιμότητα, τα φιαλίδια με μεγάλες επιφάνειες γραφής επιτρέπουν σε κάθε φιαλίδιο να φέρει επαρκή ετικέτα. Οι γραμμωτοί κώδικες 2D μπορούν να βοηθήσουν στη διαχείριση της αποθήκευσης και την τήρηση αρχείων. Τα έγχρωμα καλύμματα είναι χρήσιμα για ευκολότερη αναγνώριση.
• Επαρκής συντήρηση αποθήκευσης- Για να διασφαλιστεί ότι τα κύτταρα δεν θα χαθούν, τα δοχεία αποθήκευσης θα πρέπει να παρακολουθούν συνεχώς τη θερμοκρασία και τα επίπεδα υγρού αζώτου. Θα πρέπει να τοποθετούνται συναγερμοί για να ειδοποιούν τους χρήστες για σφάλματα.

Προφυλάξεις ασφαλείας

Το υγρό άζωτο έχει γίνει κοινή πρακτική στη σύγχρονη έρευνα, αλλά ενέχει τον κίνδυνο σοβαρού τραυματισμού εάν χρησιμοποιηθεί εσφαλμένα.

Κατά τον χειρισμό υγρού αζώτου πρέπει να χρησιμοποιείται κατάλληλος εξοπλισμός ατομικής προστασίας (ΜΑΠ) για να ελαχιστοποιείται ο κίνδυνος κρυοπαγημάτων, εγκαυμάτων και άλλων δυσμενών συμβάντων. Φθορά

• Κρυογονικά γάντια
• Εργαστηριακό παλτό
• Αντικραδασμική ασπίδα πλήρους προσώπου που καλύπτει επίσης το λαιμό
• Παπούτσια με κλειστά δάχτυλα
• Αδιάβροχη πλαστική ποδιά

Τα ψυγεία υγρού αζώτου πρέπει να τοποθετούνται σε καλά αεριζόμενους χώρους για να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος ασφυξίας – το άζωτο που διαφεύγει εξατμίζεται και εκτοπίζει το ατμοσφαιρικό οξυγόνο. Οι μεγάλες αποθήκες θα πρέπει να διαθέτουν συστήματα συναγερμού χαμηλού οξυγόνου.

Η εργασία σε ζευγάρια κατά το χειρισμό υγρού αζώτου είναι ιδανική και η χρήση του εκτός των κανονικών ωρών εργασίας θα πρέπει να απαγορεύεται.

Cryovials για υποστήριξη της ροής εργασίας σας

Η εταιρεία Suzhou Ace Biomedical προσφέρει μια μεγάλη ποικιλία προϊόντων που καλύπτουν τις ανάγκες κρυοσυντήρησής σας για διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Το χαρτοφυλάκιο περιλαμβάνει μια σειρά από σωληνάρια και μια σειρά αποστειρωμένων κρυοφιαλιδίων.

Τα κρυοφιαλάκια μας είναι:

• Lab Screw Cap 0,5mL 1,5mL 2,0mL Cryovial Cryogenic Vials Conical bottom Cryotube with Gazket

  ● Προδιαγραφή 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, με φούστα ή χωρίς φούστα
  ● Διατίθενται και οι δύο κωνικός ή αυτοσταθούμενος σχεδιασμός, αποστειρωμένος ή μη
  ● Οι σωλήνες με βιδωτό καπάκι είναι κατασκευασμένοι από πολυπροπυλένιο ιατρικής ποιότητας
  ● Τα φιαλίδια PP Cryotube μπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν επανειλημμένα
  ●Ο σχεδιασμός του εξωτερικού καλύμματος μπορεί να μειώσει την πιθανότητα μόλυνσης κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας του δείγματος.
  ● Κρυογονικοί σωλήνες με βιδωτό καπάκι Βιδωτές σπειρώματα γενικής χρήσης για χρήση
  ● Οι σωλήνες ταιριάζουν στους πιο συνηθισμένους ρότορες
  ● Οι κρυογονικοί σωλήνες ο-ring σωλήνων ταιριάζουν σε τυπικά κουτιά κατάψυξης 1 ιντσών και 2 ιντσών, 48 φρεατίων, 81 φρεατίων, 96 φρεατίων και 100 φρεατίων
  ● Αυτόκαυστο στους 121°C και κατάψυξη στους -86°C

  ΜΕΡΟΣ ΑΡΙΘ	ΥΛΙΚΟ	ΤΟΜΟΣ	ΚΑΠΑΚΙΧΡΩΜΑ	PCS/ΤΣΑΝΤΑ	ΤΣΑΝΤΕΣ/ΘΗΚΗ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Μαύρο, Κίτρινο, Μπλε, Κόκκινο, Μωβ, Λευκό	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Μαύρο, Κίτρινο, Μπλε, Κόκκινο, Μωβ, Λευκό	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Μαύρο, Κίτρινο, Μπλε, Κόκκινο, Μωβ, Λευκό	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0ML	Μαύρο, Κίτρινο, Μπλε, Κόκκινο, Μωβ, Λευκό	500	10