Εισαγωγή
Τι είναι η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος;
Με τον πιο απλό των όρων, η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος είναι η απομάκρυνση του RNA και/ή του DNA από ένα δείγμα και όλη η περίσσεια που δεν είναι απαραίτητη. Η διαδικασία εκχύλισης απομονώνει τα νουκλεϊνικά οξέα από ένα δείγμα και τα αποδίδει με τη μορφή συμπυκνωμένου έκλουστου, απαλλαγμένου από αραιωτικά και μολυντές που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τυχόν εφαρμογές κατάντη.
Εφαρμογές εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος
Τα καθαρισμένα νουκλεϊνικά οξέα χρησιμοποιούνται σε μια πληθώρα διαφορετικών εφαρμογών, που κυμαίνονται σε πολλές διαφορετικές βιομηχανίες. Η υγειονομική περίθαλψη είναι ίσως η περιοχή όπου χρησιμοποιείται περισσότερο, με καθαρισμένο RNA και DNA που απαιτούνται για πλήθος διαφορετικών διαφορετικών σκοπών δοκιμής.
Οι εφαρμογές εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος στην υγειονομική περίθαλψη περιλαμβάνουν:
- Επόμενη γενιά αλληλουχία (NGS)
- Genotyping SNP με βάση την ενίσχυση
- Γονότυπος βασισμένος σε συστοιχία
- Περίληψη ενζύμου περιορισμού
- Αναλύσεις που χρησιμοποιούν τροποποιητικά ένζυμα (π.χ. σύνδεση και κλωνοποίηση)
Υπάρχουν επίσης και άλλα πεδία πέρα από την υγειονομική περίθαλψη όπου χρησιμοποιείται η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος, συμπεριλαμβανομένων, μεταξύ άλλων, των δοκιμών πατρότητας, της εγκληματολογίας και της γονιδιωματικής.
Ένα σύντομο ιστορικό εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος
Εκχύλιση DNAχρονολογείται πολύ μακριά, με την πρώτη γνωστή απομόνωση να πραγματοποιήθηκε από έναν ελβετικό γιατρό που ονομάζεται Friedrich Miescher το 1869. Ο Miescher ελπίζει να λύσει τις θεμελιώδεις αρχές της ζωής καθορίζοντας τη χημική σύνθεση των κυττάρων. Μετά την αποτυχία με λεμφοκύτταρα, ήταν σε θέση να αποκτήσει ένα ακατέργαστο ίζημα του DNA από λευκοκύτταρα που βρέθηκαν σε πύον σε απορριπτόμενους επίδεσμους. Το έκανε αυτό προσθέτοντας οξύ και στη συνέχεια αλκαλί στο κύτταρο για να αφήσει το κυτταρόπλασμα του κυττάρου και στη συνέχεια ανέπτυξε ένα πρωτόκολλο για να διαχωρίσει το DNA από τις άλλες πρωτεΐνες.
Μετά την πρωτοποριακή έρευνα του Miescher, πολλοί άλλοι επιστήμονες έχουν προχωρήσει και αναπτύξουν τεχνικές για να απομονώσουν και να καθαρίσουν το DNA. Ο Edwin Joseph Cohn, ένας επιστήμονας πρωτεΐνης, ανέπτυξε πολλές τεχνικές για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια του WW2. Ήταν υπεύθυνος για την απομόνωση του κλάσματος αλβουμίνης ορού του πλάσματος αίματος, το οποίο είναι σημαντικό για τη διατήρηση της οσμωτικής πίεσης στα αιμοφόρα αγγεία. Αυτό ήταν ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση ζωντανών στρατιωτών.
Το 1953 ο Francis Crick, μαζί με τους Rosalind Franklin και James Watson, καθόρισαν τη δομή του DNA, δείχνοντας ότι αποτελείται από δύο σκέλη μακρών αλυσίδων νουκλεοτιδίων νουκλεϊνικού οξέος. Αυτή η ανακάλυψη ανακάλυψης άνοιξε το δρόμο για τους Meselson και Stahl, οι οποίοι ήταν σε θέση να αναπτύξουν ένα πρωτόκολλο φυγοκέντρησης βαθμίδωσης πυκνότητας για την απομόνωση του DNA από τα βακτηρίδια Ε. Coli, καθώς απέδειξαν την ημι-συντηρητική αντιγραφή του DNA κατά τη διάρκεια του πειράματος του 1958.
Τεχνικές εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος
Ποια είναι τα 4 στάδια της εκχύλισης DNA;
Όλες οι μέθοδοι εκχύλισης βράζουν στα ίδια θεμελιώδη βήματα.
Διαταραχή των κυττάρων. Αυτό το στάδιο, γνωστό και ως κυτταρική λύση, περιλαμβάνει τη διάσπαση του κυτταρικού τοιχώματος και/ή της κυτταρικής μεμβράνης, προκειμένου να απελευθερωθεί τα ενδο-κυτταρικά υγρά που περιέχουν τα νουκλεϊκά οξέα ενδιαφέροντος.
Αφαίρεση ανεπιθύμητων συντριμμιών. Αυτό περιλαμβάνει λιπίδια μεμβράνης, πρωτεΐνες και άλλα ανεπιθύμητα νουκλεϊνικά οξέα που μπορούν να παρεμβαίνουν σε εφαρμογές κατάντη.
Απομόνωση. Υπάρχουν διάφοροι διαφορετικοί τρόποι απομόνωσης των νουκλεϊνικών οξέων που ενδιαφέρουν το εκκαθαρισμένο προϊόν λύσης που δημιουργήσατε, τα οποία πέφτουν μεταξύ δύο βασικών κατηγοριών: βασισμένη σε λύση ή στερεά κατάσταση (βλ. Επόμενη ενότητα).
Συγκέντρωση. Αφού απομονώθηκαν τα νουκλεϊνικά οξέα από όλες τις άλλες μολυσματικές και αραιωμένες, παρουσιάζονται σε ένα εξαιρετικά συμπυκνωμένο έκλουσμα.
Οι δύο τύποι εξαγωγής
Υπάρχουν δύο τύποι εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος - μεθόδων που βασίζονται σε διάλυμα και μεθόδους στερεάς κατάστασης. Η μέθοδος που βασίζεται σε διάλυμα είναι επίσης γνωστή ως η μέθοδος χημικής εκχύλισης, καθώς περιλαμβάνει τη χρήση χημικών ουσιών για τη διάσπαση του κυττάρου και την πρόσβαση στο νουκλεϊνικό υλικό. Αυτό μπορεί να χρησιμοποιεί είτε οργανικές ενώσεις όπως φαινόλη και χλωροφόρμιο, είτε λιγότερο επιβλαβές και επομένως περισσότερο συνιστώμενες ανόργανες ενώσεις όπως η πρωτεϊνάση Κ ή το πυριτικό πήκτωμα.
Παραδείγματα διαφορετικών μεθόδων χημικής εκχύλισης για τη διάσπαση ενός κυττάρου περιλαμβάνουν:
- Οσμωτική ρήξη της μεμβράνης
- Ενζυματική πέψη του κυτταρικού τοιχώματος
- Διαλυτοποίηση της μεμβράνης
- με απορρυπαντικά
- με αλκαλική θεραπεία
Οι τεχνικές στερεάς κατάστασης, επίσης γνωστές ως μηχανικές μέθοδοι, περιλαμβάνουν την εκμετάλλευση του τρόπου με τον οποίο το DNA αλληλεπιδρά με ένα στερεό υπόστρωμα. Επιλέγοντας ένα σφαιρίδιο ή ένα μόριο το οποίο το DNA θα δεσμεύσει, αλλά η αναλυτική ουσία δεν θα είναι, είναι δυνατόν να διαχωριστούν τα δύο. Παραδείγματα τεχνικών εκχύλισης στερεάς φάσης, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης πυριτίας και μαγνητικών σφαιριδίων.
Εξήγησε η εξαγωγή μαγνητικών σφαιριδίων
Η μέθοδος εξαγωγής μαγνητικών σφαιριδίων
Η δυνατότητα εξαγωγής που χρησιμοποιεί μαγνητικά σφαιρίδια αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά σε ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας των ΗΠΑ που κατατέθηκε από τον Trevor Hawkins, για το ερευνητικό ίδρυμα του Whitehead Institute. Αυτό το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας αναγνώρισε ότι ήταν δυνατόν να εξαχθεί το γενετικό υλικό συνδέοντάς τα σε έναν σταθερό φορέα υποστήριξης, ο οποίος θα μπορούσε να είναι ένα μαγνητικό σφαιρίδιο. Η αρχή είναι ότι χρησιμοποιείτε ένα εξαιρετικά λειτουργικό μαγνητικό σφαιρίδιο πάνω στο οποίο θα δεσμεύεται το γενετικό υλικό, το οποίο στη συνέχεια μπορεί να διαχωριστεί από το υπερκείμενο εφαρμόζοντας μια μαγνητική δύναμη στο εξωτερικό του σκάφους που κρατά το δείγμα.
Γιατί να χρησιμοποιήσετε την εξαγωγή μαγνητικών σφαιριδίων;
Η τεχνολογία εκχύλισης μαγνητικών σφαιριδίων γίνεται ολοένα και πιο διαδεδομένη, λόγω του δυναμικού που κατέχει για γρήγορες και αποτελεσματικές διαδικασίες εκχύλισης. Τον τελευταίο καιρό υπήρξαν εξελίξεις σε εξαιρετικά λειτουργικά μαγνητικά σφαιρίδια με κατάλληλα ρυθμιστικά συστήματα, τα οποία έχουν καταστήσει πιθανή αυτοματοποίηση της εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος και μιας ροής εργασίας που είναι πολύ ελαφρύ και οικονομικά αποδοτικό. Επίσης, οι μέθοδοι εκχύλισης μαγνητικών σφαιριδίων δεν περιλαμβάνουν τα βήματα φυγοκέντρησης που μπορούν να προκαλέσουν δυνάμεις διάτμησης που διαλύουν μακρύτερα κομμάτια DNA. Αυτό σημαίνει ότι οι μακρύτερες σκέλη του DNA παραμένουν άθικτες, οι οποίες είναι σημαντικές στη δοκιμή γονιδιωματικής.
Χρόνος δημοσίευσης: Νοέμβριος-25-2022