Ακόμα κι αν θεωρητικά, ένα μόριο του εκμαγείου θα ήταν αρκετό, πολύ μεγαλύτερες ποσότητες DNA χρησιμοποιούνται τυπικά για μια κλασική PCR, για παράδειγμα, έως 1 μg γονιδιωματικού DNA θηλαστικού και μόλις 1 pg πλασμιδικού DNA. Η βέλτιστη ποσότητα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τον αριθμό των αντιγράφων της αλληλουχίας στόχου, καθώς και από την πολυπλοκότητά της.
Εάν χρησιμοποιείται πολύ λίγο πρότυπο, θα χρειαστεί αντίστοιχη αύξηση στον αριθμό των κύκλων ενίσχυσης για να ληφθεί επαρκής ποσότητα προϊόντος. Μια πολυμεράση Taq που χρησιμοποιείται για τα περισσότερα πειράματα PCR δεν διαθέτει συνάρτηση διόρθωσης (δραστηριότητα εξωνουκλεάσης 3'-5'). Έτσι, τα σφάλματα που εμφανίζονται κατά την ενίσχυση δεν μπορούν να διορθωθούν. Όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των κύκλων, τόσο πιο διαδεδομένη θα είναι η ενίσχυση του ελαττωματικού προϊόντος. Εάν, από την άλλη πλευρά, η ποσότητα του εκμαγείου είναι πολύ υψηλή, η πιθανότητα ανόπτησης εκκινητών σε άλλες (όχι εκατό τοις εκατό συμπληρωματικές) αλληλουχίες, καθώς και ο σχηματισμός διμερών εκκινητών, θα αυξηθεί, γεγονός που θα έχει ως αποτέλεσμα την ενίσχυση υποπροϊόντα. Σε πολλές περιπτώσεις, το DNA απομονώνεται από καλλιέργειες κυττάρων ή από μικροοργανισμούς και στη συνέχεια χρησιμοποιείται ως εκμαγείο PCR. Μετά τον καθαρισμό, είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του DNA για να μπορέσουμε να ορίσουμε τον όγκο που απαιτείται για τη ρύθμιση της PCR. Ενώ η ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης μπορεί να χρησιμεύσει για την παροχή μιας εκτίμησης, αυτή η μέθοδος απέχει πολύ από το να είναι ακριβής. Η φασματοφωτομετρία UV-Vis έχει καθιερωθεί ως το χρυσό πρότυπο για τον ποσοτικό προσδιορισμό των νουκλεϊκών οξέων. Αυτή η άμεση και επομένως εύκολη και γρήγορη μέθοδος μετρά την απορρόφηση του δείγματος στα 260 nm και η συγκέντρωση υπολογίζεται με τη βοήθεια ενός συντελεστή μετατροπής.
Εάν, ωστόσο, η συγκέντρωση του DNA είναι πολύ χαμηλή (< 1 μg/mL dsDNA) ή εάν έχει μολυνθεί με ουσίες που απορροφούν επίσης στην περιοχή των 260 nm (π.χ. RNA, πρωτεΐνη, άλατα), αυτή η μέθοδος θα φτάσει τους περιορισμούς της. Στην περίπτωση πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων, οι μετρήσεις θα γίνουν σύντομα πολύ ανακριβείς για να είναι χρήσιμες και οι μολύνσεις θα οδηγήσουν σε (μερικές φορές τεράστια) υπερεκτίμηση της πραγματικής τιμής. Σε αυτή την περίπτωση, η ποσοτικοποίηση με χρήση φθορισμού μπορεί να αποτελέσει εναλλακτική λύση. Αυτή η τεχνική βασίζεται στη χρήση μιας φθορίζουσας χρωστικής που συνδέεται ειδικά με το dsDNA μόνο το σύμπλοκο που περιλαμβάνει νουκλεϊκό οξύ και η βαφή διεγείρεται από το φως και στη συνέχεια θα εκπέμπει φως ελαφρώς υψηλότερου μήκους κύματος. Εδώ, η ένταση του σήματος φθορισμού είναι ανάλογη με την ποσότητα του DNA και για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης αξιολογείται σε σχέση με μια τυπική καμπύλη. Τα πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου βασίζονται στην εξειδίκευση του δεσμού, η οποία αποκλείει τις εξωτερικές επιδράσεις που εισάγονται από τη μόλυνση, καθώς και στην προκύπτουσα ικανότητα ανίχνευσης πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων DNA. Η καταλληλότητα κάθε μεθόδου εξαρτάται κυρίως από τη συγκέντρωση και την καθαρότητα του δείγματος. Σε πολλές περιπτώσεις μπορεί ακόμη και να είναι σκόπιμο να εφαρμοστούν και οι δύο μέθοδοι παράλληλα.
Ώρα δημοσίευσης: Νοε-30-2022