Kryoröhrchenwerden üblicherweise zur kryogenen Lagerung von Zelllinien und anderen kritischen biologischen Materialien in mit flüssigem Stickstoff gefüllten Dewargefäßen verwendet.

Die erfolgreiche Konservierung von Zellen in flüssigem Stickstoff umfasst mehrere Schritte. Während das Grundprinzip ein langsames Einfrieren ist, hängt die genaue angewandte Technik vom Zelltyp und dem verwendeten Kryoschutzmittel ab. Bei der Lagerung von Zellen bei solch niedrigen Temperaturen sind verschiedene Sicherheitsaspekte und Best Practices zu berücksichtigen.

Dieser Beitrag soll einen Überblick darüber geben, wie Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

Was sind Kryoröhrchen?

Kryoröhrchen sind kleine, verschlossene Fläschchen, die für die Lagerung flüssiger Proben bei extrem niedrigen Temperaturen konzipiert sind. Sie stellen sicher, dass im Kryoschutzmittel konservierte Zellen nicht in direkten Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff kommen, wodurch das Risiko von Zellbrüchen minimiert wird und gleichzeitig von der extremen Kühlwirkung des flüssigen Stickstoffs profitiert wird.

Die Fläschchen sind in der Regel in verschiedenen Volumina und Ausführungen erhältlich – sie können ein Innen- oder Außengewinde mit flachem oder abgerundetem Boden haben. Es sind auch sterile und unsterile Formate erhältlich.

Wer nutztCyrovialszur Lagerung von Zellen in flüssigem Stickstoff

Eine Reihe von NHS- und privaten Labors sowie Forschungseinrichtungen, die auf Nabelschnurblutbanking, Epithelzellbiologie, Immunologie und Stammzellbiologie spezialisiert sind, verwenden Kryoröhrchen zur Kryokonservierung von Zellen.

Zu den auf diese Weise konservierten Zellen gehören B- und T-Zellen, CHO-Zellen, hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen, Hybridome, Darmzellen, Makrophagen, mesenchymale Stamm- und Vorläuferzellen, Monozyten, Myelome, NK-Zellen und pluripotente Stammzellen.

Überblick über die Lagerung von Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff

Kryokonservierung ist ein Prozess, bei dem Zellen und andere biologische Konstrukte durch Abkühlen auf sehr niedrige Temperaturen konserviert werden. Zellen können jahrelang in flüssigem Stickstoff gelagert werden, ohne dass die Zelllebensfähigkeit verloren geht. Dies ist ein Überblick über die eingesetzten Verfahren.

Zellvorbereitung

Die genaue Methode zur Probenvorbereitung variiert je nach Zelltyp. Im Allgemeinen werden die Zellen jedoch gesammelt und zentrifugiert, um ein zellreiches Pellet zu entwickeln. Dieses Pellet wird dann im Überstand, gemischt mit Kryoschutzmittel oder einem Kryokonservierungsmedium, resuspendiert.

Kryokonservierungsmedium

Dieses Medium wird verwendet, um Zellen in der Umgebung mit niedrigen Temperaturen zu konservieren, denen sie ausgesetzt sind, indem es die Bildung intra- und extrazellulärer Kristalle und damit den Zelltod hemmt. Ihre Aufgabe besteht darin, eine sichere, schützende Umgebung für Zellen und Gewebe während des Gefrier-, Lagerungs- und Auftauprozesses zu schaffen.

Ein Medium wie frisch gefrorenes Plasma (FFP), heparinisierte Plasmalytlösung oder serumfreie, tierische Komponenten-freie Lösungen wird mit Kryoschutzmitteln wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Glycerin gemischt.

Das erneut verflüssigte Probenpellet wird in Polypropylen-Kryoröhrchen wie z. B. aliquotiertSuzhou Ace Biomedical-Unternehmen, kryogene Lagerfläschchen.

Es ist wichtig, die Kryoröhrchen nicht zu überfüllen, da dies das Risiko einer Rissbildung und einer möglichen Freisetzung des Inhalts erhöht (1).

Kontrollierte Gefrierrate

Im Allgemeinen wird für die erfolgreiche Kryokonservierung von Zellen eine langsame kontrollierte Gefrierrate eingesetzt.

Nachdem die Proben in Kryofläschchen aufgeteilt wurden, werden sie auf nasses Eis oder in einen 4℃-Kühlschrank gestellt und der Gefriervorgang wird innerhalb von 5 Minuten gestartet. Als allgemeiner Richtwert gilt, dass Zellen mit einer Geschwindigkeit von -1 bis -3 pro Minute gekühlt werden (2). Dies wird durch die Verwendung eines programmierbaren Kühlers oder durch die Platzierung der Fläschchen in einer isolierten Box in einem Gefrierschrank mit kontrollierter Temperatur von –70 °C bis –90 °C erreicht.

Übertragen auf flüssigen Stickstoff

Die gefrorenen Kryofläschchen werden dann für unbestimmte Zeit in einen Flüssigstickstofftank überführt, sofern eine Temperatur von weniger als -135 °C aufrechterhalten wird.

Diese extrem niedrigen Temperaturen können durch Eintauchen in flüssigen oder dampfförmigen Stickstoff erreicht werden.

Flüssig- oder Dampfphase?

Es ist bekannt, dass die Lagerung in flüssigem Stickstoff die kalte Temperatur absolut konstant hält, wird jedoch aus folgenden Gründen häufig nicht empfohlen:

• Der Bedarf an großen Mengen (Tiefe) flüssigen Stickstoffs stellt eine potenzielle Gefahr dar. Verbrennungen oder Erstickung sind hierdurch ein echtes Risiko.
• Dokumentierte Fälle von Kreuzkontamination durch Infektionserreger wie Aspergillus, Hep B und Virusausbreitung über das flüssige Stickstoffmedium (2,3)
• Es besteht die Möglichkeit, dass beim Eintauchen flüssiger Stickstoff in die Fläschchen gelangt. Beim Herausnehmen aus dem Lager und Erwärmen auf Raumtemperatur dehnt sich der Stickstoff schnell aus. Folglich kann das Fläschchen zerspringen, wenn es aus der Lagerung von flüssigem Stickstoff entnommen wird, was eine Gefahr sowohl durch umherfliegende Trümmer als auch durch den Kontakt mit dem Inhalt darstellt (1, 4).

Aus diesen Gründen erfolgt die Lagerung bei extrem niedrigen Temperaturen am häufigsten in Stickstoff in der Dampfphase. Wenn Proben in der flüssigen Phase gelagert werden müssen, sollten spezielle Kryoflex-Schläuche verwendet werden.

Der Nachteil der Dampfphase besteht darin, dass ein vertikaler Temperaturgradient auftreten kann, der zu Temperaturschwankungen zwischen -135℃ und -190℃ führt. Dies erfordert eine sorgfältige und sorgfältige Überwachung des Flüssigstickstoffgehalts und der Temperaturschwankungen (5).

Viele Hersteller empfehlen, dass Kryoröhrchen für die Lagerung bei bis zu -135 °C oder nur für die Verwendung in der Dampfphase geeignet sind.

Auftauen Ihrer kryokonservierten Zellen

Der Auftauvorgang ist für eine gefrorene Kultur stressig und es sind eine ordnungsgemäße Handhabung und Technik erforderlich, um eine optimale Lebensfähigkeit, Erholung und Funktionalität der Zellen sicherzustellen. Die genauen Auftauprotokolle hängen von den jeweiligen Zelltypen ab. Allerdings gilt ein schnelles Auftauen als Standard für:

• Verringern Sie jegliche Auswirkungen auf die Zellerholung
• Verkürzen Sie die Einwirkzeit gegenüber den im Gefriermedium vorhandenen gelösten Stoffen
• Schäden durch Eisrekristallisation minimieren

Zum Auftauen von Proben werden üblicherweise Wasserbäder, Perlenbäder oder spezielle automatisierte Instrumente verwendet.

Am häufigsten wird jeweils eine Zelllinie 1–2 Minuten lang aufgetaut, indem man sie vorsichtig in einem 37 °C warmen Wasserbad schwenkt, bis nur noch ein kleiner Rest Eis im Fläschchen übrig ist, bevor sie in einem vorgewärmten Wachstumsmedium gewaschen wird.

Für einige Zellen, beispielsweise Säugetierembryonen, ist eine langsame Erwärmung überlebenswichtig.

Die Zellen sind nun bereit für die Zellkultur, Zellisolierung oder, im Fall von hämatopoetischen Stammzellen, für Lebensfähigkeitsstudien, um die Integrität der Spenderstammzellen vor der myeloablativen Therapie zu gewährleisten.

Es ist üblich, kleine Aliquots der vorgewaschenen Probe zu entnehmen, die zur Durchführung einer Zellzählung verwendet werden, um die Zellkonzentrationen für die Ausplattierung in Kultur zu bestimmen. Anschließend können Sie die Ergebnisse der Zellisolierungsverfahren bewerten und die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmen.

Best Practices für die Lagerung von Kryoröhrchen

Die erfolgreiche Kryokonservierung von in Kryofläschchen gelagerten Proben hängt von vielen Elementen des Protokolls ab, einschließlich der ordnungsgemäßen Lagerung und Aufzeichnung.

• Teilen Sie Zellen zwischen Speicherorten auf– Wenn es die Volumina zulassen, teilen Sie die Zellen auf Fläschchen auf und lagern Sie sie an getrennten Orten, um das Risiko von Probenverlusten aufgrund von Geräteausfällen zu verringern.
• Kreuzkontaminationen verhindern– Entscheiden Sie sich für sterile Kryofläschchen zum Einmalgebrauch oder autoklavieren Sie sie vor der späteren Verwendung
• Verwenden Sie für Ihre Zellen entsprechend große Fläschchen– Fläschchen gibt es in verschiedenen Volumina zwischen 1 und 5 ml. Vermeiden Sie ein Überfüllen der Fläschchen, um das Risiko von Rissen zu verringern.
• Wählen Sie Kryofläschchen mit Innen- oder Außengewinde– Fläschchen mit Innengewinde werden von einigen Universitäten aus Sicherheitsgründen empfohlen – sie können auch eine Kontamination beim Befüllen oder bei der Lagerung im flüssigen Stickstoff verhindern.
• Leckage verhindern- Verwenden Sie in den Schraubdeckel eingegossene Bi-Injection-Dichtungen oder O-Ringe, um Leckagen und Verunreinigungen zu verhindern.
• Verwenden Sie 2D-Barcodes und etikettieren Sie Fläschchen– Um die Rückverfolgbarkeit zu gewährleisten, ermöglichen Fläschchen mit großer Beschriftungsfläche eine angemessene Beschriftung jedes Fläschchens. 2D-Barcodes können bei der Lagerverwaltung und Aufzeichnungen helfen. Zur leichteren Identifizierung sind farblich gekennzeichnete Kappen hilfreich.
• Angemessene Lagerwartung- Um sicherzustellen, dass keine Zellen verloren gehen, sollten die Lagerbehälter ständig die Temperatur und den Gehalt an flüssigem Stickstoff überwachen. Alarme sollten angebracht werden, um Benutzer auf Fehler aufmerksam zu machen.

Sicherheitsvorkehrungen

Flüssiger Stickstoff ist in der modernen Forschung mittlerweile gängige Praxis, birgt jedoch bei unsachgemäßer Anwendung das Risiko schwerer Verletzungen.

Um das Risiko von Erfrierungen, Verbrennungen und anderen unerwünschten Ereignissen beim Umgang mit flüssigem Stickstoff zu minimieren, sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden. Tragen

• Kryo-Handschuhe
• Laborkittel
• Schlagfester Vollgesichtsschutz, der auch den Hals bedeckt
• Geschlossene Schuhe
• Spritzwassergeschützte Kunststoffschürze

Kühlschränke mit flüssigem Stickstoff sollten in gut belüfteten Bereichen aufgestellt werden, um die Erstickungsgefahr zu minimieren – entwichener Stickstoff verdampft und verdrängt Luftsauerstoff. Großvolumige Geschäfte sollten über Alarmsysteme für Sauerstoffmangel verfügen.

Beim Umgang mit flüssigem Stickstoff ist das Arbeiten zu zweit ideal und der Einsatz außerhalb der normalen Arbeitszeiten sollte untersagt werden.

Kryoröhrchen zur Unterstützung Ihres Arbeitsablaufs

Das Unternehmen Suzhou Ace Biomedical bietet eine große Auswahl an Produkten, die Ihren Kryokonservierungsanforderungen für verschiedene Zelltypen gerecht werden. Das Portfolio umfasst eine Reihe von Röhrchen sowie eine Reihe steriler Kryoröhrchen.

Unsere Kryoröhrchen sind:

• Laborschraubverschluss 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Kryovial-Kryoröhrchen mit konischem Boden und Dichtung

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Spezifikation, mit Rock oder ohne Rock
  ● Konisches oder freistehendes Design, steril oder unsteril sind beide erhältlich
  ● Röhrchen mit Schraubverschluss bestehen aus Polypropylen in medizinischer Qualität
  ● PP-Kryoröhrchenfläschchen können wiederholt eingefroren und aufgetaut werden
  ●Das Design der externen Kappe kann die Kontaminationswahrscheinlichkeit während der Probenbehandlung verringern.
  ● Kryo-Röhrchen mit Schraubverschluss. Universelle Schraubgewinde für den Einsatz
  ● Röhren passen auf die meisten gängigen Rotoren
  ● Kryorohr-O-Ring-Rohre passen auf Standard-Gefrierboxen mit 1 Zoll und 2 Zoll, 48 Well, 81 Well, 96 Well und 100 Well
  ● Autoklavierbar bis 121 °C und einfrierbar bis -86 °C

  TEIL NR	MATERIAL	VOLUMEN	KAPPEFARBE	Stück/TASCHE	TASCHEN/KOFFER
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Schwarz, Gelb, Blau, Rot, Lila, Weiß	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Schwarz, Gelb, Blau, Rot, Lila, Weiß	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Schwarz, Gelb, Blau, Rot, Lila, Weiß	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Schwarz, Gelb, Blau, Rot, Lila, Weiß	500	10