Die Standardisierung von Prozessen umfasst deren Optimierung und anschließende Etablierung und Harmonisierung, um eine dauerhaft optimale Performance zu ermöglichen – unabhängig vom Anwender. Die Standardisierung gewährleistet qualitativ hochwertige Ergebnisse sowie deren Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit.
Das Ziel der (klassischen) PCR ist die Generierung eines zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnisses. Für bestimmte Anwendungen ist die Ausbeute derPCR-Produktist auch relevant. Bei diesen Reaktionen muss darauf geachtet werden, dass die Proben nicht beeinträchtigt werden und der PCR-Workflow stabil bleibt. Konkret geht es dabei um die Minimierung des Eintrags von Kontaminationen, die zu falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen führen oder sogar die PCR-Reaktion hemmen könnten. Darüber hinaus sollten die Reaktionsbedingungen für jede einzelne Probe innerhalb eines Laufs möglichst identisch sein und auch auf Folgereaktionen (der gleichen Methode) übertragbar sein. Dies betrifft sowohl die Zusammensetzung der Reaktionen als auch die Art der Temperaturführung im Cycler. Selbstverständlich sind Benutzerfehler weitestgehend zu vermeiden.
Im Folgenden zeigen wir, welche Herausforderungen bei der Vorbereitung und im Verlauf einer PCR auftreten – und welche Lösungsansätze es im Hinblick auf Instrumente und Verbrauchsmaterialien zur Standardisierung der PCR-Workflows gibt.
Reaktionsvorbereitung
Die Dosierung von Reaktionskomponenten in PCR-Gefäße bzw. Platten birgt zahlreiche Herausforderungen, die es zu bewältigen gilt:
Reaktionsbedingungen
Um möglichst identische Reaktionsbedingungen anzustreben, ist die exakte und präzise Dosierung der einzelnen Komponenten unerlässlich. Neben einer guten Pipettiertechnik ist die Auswahl des richtigen Werkzeugs entscheidend. PCR-Mastermixe enthalten häufig Substanzen, die die Viskosität erhöhen oder Schaum erzeugen. Diese führen beim Pipettieren zu einer starken Benetzung der FlüssigkeitPipettenspitzen, wodurch die Pipettiergenauigkeit verringert wird. Durch den Einsatz von Direktdosiersystemen oder alternativen Pipettenspitzen, die weniger zur Benetzung neigen, kann die Genauigkeit und Präzision des Pipettiervorgangs verbessert werden.
Verunreinigungen
Während des Dosiervorgangs entstehen Aerosole, die, wenn sie in das Innere der Pipette gelangen, möglicherweise beim nächsten Pipettierschritt eine andere Probe kontaminieren können. Dies kann durch den Einsatz von Filterspitzen oder Direktverdrängungssystemen verhindert werden.
Verbrauchsmaterialien wie zTippsGefäße und Platten, die im PCR-Workflow verwendet werden, dürfen keine Substanzen enthalten, die die Probe beeinträchtigen oder das Ergebnis verfälschen. Dazu gehören DNA, DNasen, RNasen und PCR-Inhibitoren sowie Komponenten, die während der Reaktion möglicherweise aus dem Material austreten können – Substanzen, die als Leachables bezeichnet werden.
Benutzerfehler
Je mehr Proben verarbeitet werden, desto höher ist das Fehlerrisiko. Es kann leicht passieren, dass eine Probe in das falsche Gefäß oder die falsche Vertiefung pipettiert wird. Dieses Risiko lässt sich durch eine gut erkennbare Markierung der Vertiefungen erheblich reduzieren. Durch die Automatisierung von Dosierschritten wird der „Faktor Mensch“, also Fehler und anwenderbedingte Schwankungen, minimiert und so die Reproduzierbarkeit, insbesondere bei kleinen Reaktionsvolumina, erhöht. Voraussetzung dafür ist, dass an einem Arbeitsplatz Platten mit ausreichender Formstabilität eingesetzt werden. Angebrachte Barcodes sorgen für zusätzliche Maschinenlesbarkeit, was die Probenverfolgung im gesamten Prozess vereinfacht.
Programmierung des Thermocyclers
Die Programmierung eines Instruments kann sowohl zeitaufwändig als auch fehleranfällig sein. Verschiedene Funktionen des PCR-Thermocyclers arbeiten zusammen, um diesen Prozessschritt zu vereinfachen und vor allem sicher zu machen:
Einfache Bedienung und gute Benutzerführung sind die Basis einer effizienten Programmierung. Auf dieser Grundlage soll eine passwortgeschützte Benutzerverwaltung verhindern, dass die eigenen Programme durch andere Benutzer verändert werden. Wenn mehrere Cycler (gleichen Typs) im Einsatz sind, ist es von Vorteil, wenn ein Programm über USB oder Konnektivität direkt von einem Gerät auf ein anderes übertragen werden kann. Computersoftware ermöglicht die zentrale und sichere Verwaltung von Programmen, Benutzerrechten und Dokumenten auf einem Computer.
PCR-Lauf
Während des Laufs wird die DNA im Reaktionsgefäß amplifiziert, wobei jede Probe identischen, konsistenten Reaktionsbedingungen ausgesetzt werden sollte. Für den Prozess sind folgende Aspekte relevant:
Temperaturkontrolle
Hervorragende Genauigkeit bei der Temperaturkontrolle und Homogenität des Cycler-Blocks sind die Grundlage für eine gleichmäßige Temperaturkonditionierung aller Proben. Die hohe Qualität der Heiz- und Kühlelemente (Peltier-Elemente) sowie die Art und Weise, wie diese mit dem Block verbunden sind, sind ausschlaggebend für das Risiko von Temperaturunterschieden, dem sogenannten „Kanteneffekt“.
Verdunstung
Die Konzentrationen der einzelnen Reaktionskomponenten sollten sich im Verlauf der Reaktion nicht durch Verdunstung verändern. Ansonsten ist es möglich, dass sehr wenigPCR-Produktgeneriert werden, oder gar keine. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Verdunstung durch eine sichere Abdichtung zu minimieren. Dabei arbeiten der beheizte Deckel des Thermocyclers und der Verschluss des Gefäßes Hand in Hand. Es stehen verschiedene Dichtungsmöglichkeiten zur VerfügungPCR-Platten (Link: Artikel Versiegelung), wobei die beste Versiegelung durch Heißsiegeln erreicht wird. Auch andere Verschlüsse können geeignet sein, sofern der Anpressdruck des Cycler-Deckels an die gewählte Dichtung angepasst werden kann.
Um langfristig genaue und reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen, erfolgt eine Prozessstandardisierung. Dazu gehört die regelmäßige Wartung der Geräte, um sicherzustellen, dass sie stets in gutem Betriebszustand sind. Sämtliche Verbrauchsmaterialien müssen über alle Produktionschargen hinweg eine gleichbleibend hohe Qualität aufweisen und eine zuverlässige Verfügbarkeit gewährleistet sein.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 29. November 2022