Nukleinsäurextraktion und die magnetische Perlenmethode

Einführung

Was ist Nukleinsäure -Extraktion?

In den Begriffen ist die Nukleinsäure -Extraktion die Entfernung der RNA und/oder der DNA aus einer Probe und den gesamten Überschuss, der nicht erforderlich ist. Der Prozess der Extraktion isoliert die Nukleinsäuren aus einer Probe und ergibt sie in Form eines konzentrierten Eluates, frei von Verdünnungsmittel und Verunreinigungen, die alle nachgeschalteten Anwendungen beeinflussen könnten.

Anwendungen der Nukleinsäurextraktion

Gereinigte Nukleinsäuren werden in einer Fülle verschiedener Anwendungen verwendet, die in mehreren verschiedenen Branchen reichen. Das Gesundheitswesen ist vielleicht der Bereich, in dem sie am meisten verwendet wird, wobei gereinigte RNA und DNA für eine Vielzahl verschiedener Testzwecke erforderlich sind.

Zu den Anwendungen der Nukleinsäurextraktion im Gesundheitswesen gehören:

- PCR- und QPCR -Amplifikation

- Sequenzierung der nächsten Generation (NGS)

- Amplifikationsbasierte SNP-Genotypisierung

- Array-basierte Genotypisierung

- Beschränkungsenzymverdauung

- Analysen mit modifizierenden Enzymen (z. B. Ligation und Klonen)

Es gibt auch andere Felder außerhalb des Gesundheitswesens, in denen die Nukleinsäurextraktion verwendet wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Vaterschaftstests, Forensik und Genomik.

Eine kurze Vorgeschichte der Nukleinsäurehäuse

DNA -Extraktionstammt weit zurück, wobei die erste bekannte Isolation 1869 von einem Schweizer Arzt namens Friedrich Miescher durchgeführt wurde. Miescher hoffte, die Grundprinzipien des Lebens durch die Bestimmung der chemischen Zusammensetzung von Zellen zu lösen. Nachdem er mit Lymphozyten versagt hatte, konnte er einen rohen Niederschlag von DNA aus Leukozyten erhalten, die in Eiter auf weggeworfenen Bandagen gefunden wurden. Er tat dies, indem er Säure und dann Alkali zur Zelle hinzufügte, um das Zytoplasma der Zelle zu verlassen, und entwickelte dann ein Protokoll, um die DNA von den anderen Proteinen zu trennen.

Nach der bahnbrechenden Forschung von Miescher haben viele andere Wissenschaftler Techniken voranschreiten und entwickelt, um DNA zu isolieren und zu reinigen. Edwin Joseph Cohn, ein Proteinwissenschaftler, entwickelte während des Zweiten Weltkriegs viele Techniken zur Proteinreinigung. Er war für die Isolierung des Serumalbuminanteils von Blutplasma verantwortlich, was für die Aufrechterhaltung des osmotischen Drucks in den Blutgefäßen wichtig ist. Dies war entscheidend, um Soldaten am Leben zu erhalten.

1953 stellte Francis Crick zusammen mit Rosalind Franklin und James Watson die Struktur der DNA fest und zeigte, dass es aus zwei Strängen langer Ketten von Nukleinsäurernukleotiden bestand. Diese Durchbrüche entdeckte den Weg für Meselson und Stahl, die in der Lage waren, ein Dichtegradient-Zentrifugationsprotokoll zu entwickeln, um DNA von E. coli-Bakterien zu isolieren, als sie die semi-konservative Replikation von DNA während ihres Experiments von 1958 demonstrierten.

Techniken der Nukleinsäurextraktion

Was sind die 4 Stadien der DNA -Extraktion?
Alle Extraktionsmethoden sind auf die gleichen grundlegenden Schritte zurückzuführen.

Zellstörung. Diese Stufe, auch als Zelllyse bekannt, beinhaltet das Zerbrechen der Zellwand und/oder der Zellmembran, damit die intra-zellulären Flüssigkeiten, die die interessierenden Nukleinsäuren enthalten, freisetzen.

Entfernung unerwünschter Trümmer. Dies umfasst Membranlipide, Proteine ​​und andere unerwünschte Nukleinsäuren, die die nachgeschalteten Anwendungen beeinträchtigen können.

Isolierung. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die interessierenden Nukleinsäuren aus dem von Ihnen erstellten gelöschten Lysat zu isolieren, die zwischen zwei Hauptkategorien fallen: lösungsbasiertes oder fester Zustand (siehe nächster Abschnitt).

Konzentration. Nachdem die Nukleinsäuren aus allen anderen Verunreinigungen und Verdünnungen isoliert wurden, werden sie in einem hochkonzentrierten Eluat präsentiert.

Die beiden Arten der Extraktion
Es gibt zwei Arten von Nukleinsäureextraktion - Lösungsbasierte Methoden und Festkörpermethoden. Die lösungsbasierte Methode ist auch als die chemische Extraktionsmethode bekannt, da Chemikalien verwendet werden, um die Zelle abzubauen und auf das Nukleinatmaterial zuzugreifen. Dies kann entweder organische Verbindungen wie Phenol und Chloroform oder die weniger schädlichen und daher empfohlenen anorganischen Verbindungen wie Proteinase K oder Siliciumdiengel verwenden.

Beispiele für verschiedene chemische Extraktionsmethoden, um eine Zelle abzubauen, umfassen:

- osmotisches Bruch der Membran

- enzymatische Verdauung der Zellwand

- Solubilisierung von Membran

- mit Reinigungsmitteln

- Mit Alkali -Behandlung

Festkörpertechniken, auch als mechanische Methoden bezeichnet, beinhalten die Nutzung der Wechselwirkung der DNA mit einem festen Substrat. Durch die Auswahl einer Perle oder Molekül, an die die DNA binden wird, aber der Analyte nicht, ist es möglich, die beiden zu trennen. Beispiele für Festphasenextraktionstechniken, einschließlich der Verwendung von Kieselsäure und Magnetkügelchen.

Magnetische Perlenextraktion erklärt

Die Magnetkügelchen -Extraktionsmethode
Das Extraktionspotential unter Verwendung von Magnetkügelchen wurde erstmals in einem US -Patent von Trevor Hawkins für die Forschungsinstitution des Whitehead Institute anerkannt. Dieses Patent räumte ein, dass es möglich sei, genetisches Material zu extrahieren, indem sie an einen festen Trägerbagierbindung gebunden wurden, was eine magnetische Perle sein könnte. Das Prinzip ist, dass Sie eine hochfunktionalisierte Magnetkügelchen verwenden, an die das genetische Material binden, das dann vom Überstand getrennt werden kann, indem eine Magnetkraft auf die Außenseite des Gefäßes angewendet wird, das die Probe hält.

Warum magnetische Perlenextraktion verwenden?
Die magnetische Perlenextraktionstechnologie wird aufgrund des Potenzials für schnelle und effiziente Extraktionsverfahren immer häufiger. In jüngster Zeit gab es Entwicklungen hochfunktionalisierter magnetischer Perlen mit geeigneten Puffersystemen, die die Automatisierung der Nukleinsäure-Extraktion und eines Workflows ermöglicht haben, der sehr ressourcenlicht und kosteneffizient ist. Außerdem umfassen Magnetkügelchen -Extraktionsmethoden nicht die Zentrifugationsschritte, die Scherkräfte verursachen können, die längere DNA -Stücke aufbrechen. Dies bedeutet, dass längere DNA -Stränge intakt bleiben, was für die Genomik -Tests wichtig ist.