Nukleinsäureextraktion und die Magnetkügelchen-Methode

Einführung

Was ist Nukleinsäureextraktion?

Im einfachsten Sinne ist die Nukleinsäureextraktion die Entfernung der RNA und/oder DNA aus einer Probe und aller nicht notwendigen Überschüsse. Der Extraktionsprozess isoliert die Nukleinsäuren aus einer Probe und liefert sie in Form eines konzentrierten Eluats, frei von Verdünnungsmitteln und Verunreinigungen, die sich auf nachgelagerte Anwendungen auswirken könnten.

Anwendungen der Nukleinsäureextraktion

Gereinigte Nukleinsäuren werden in einer Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen in zahlreichen Branchen eingesetzt. Das Gesundheitswesen ist vielleicht der Bereich, in dem es am häufigsten eingesetzt wird, da gereinigte RNA und DNA für eine Vielzahl unterschiedlicher Testzwecke benötigt werden.

Zu den Anwendungen der Nukleinsäureextraktion im Gesundheitswesen gehören:

- PCR- und qPCR-Amplifikation

- Next Generation Sequencing (NGS)

- Amplifikationsbasierte SNP-Genotypisierung

- Array-basierte Genotypisierung

- Restriktionsenzymverdauung

- Analysen mit modifizierenden Enzymen (z. B. Ligation und Klonierung)

Es gibt auch andere Bereiche außerhalb des Gesundheitswesens, in denen die Nukleinsäureextraktion eingesetzt wird, darunter unter anderem Vaterschaftstests, Forensik und Genomik.

Eine kurze Geschichte der Nukleinsäureextraktion

DNA-Extraktionreicht weit zurück: Die erste bekannte Isolierung wurde 1869 von einem Schweizer Arzt namens Friedrich Miescher durchgeführt. Miescher hoffte, die Grundprinzipien des Lebens durch die Bestimmung der chemischen Zusammensetzung von Zellen zu entschlüsseln. Nachdem er mit den Lymphozyten fehlgeschlagen war, gelang es ihm, aus Leukozyten, die im Eiter auf weggeworfenen Verbänden gefunden wurden, einen rohen DNA-Niederschlag zu gewinnen. Er tat dies, indem er der Zelle zunächst Säure und dann Alkali hinzufügte, um das Zytoplasma der Zelle zu verlassen, und dann ein Protokoll entwickelte, um die DNA von den anderen Proteinen zu trennen.

Im Anschluss an Mieschers bahnbrechende Forschung haben viele andere Wissenschaftler Techniken zur Isolierung und Reinigung von DNA weiterentwickelt und weiterentwickelt. Edwin Joseph Cohn, ein Proteinwissenschaftler, entwickelte im Zweiten Weltkrieg viele Techniken zur Proteinreinigung. Er war für die Isolierung der Serumalbumin-Fraktion des Blutplasmas verantwortlich, die für die Aufrechterhaltung des osmotischen Drucks in den Blutgefäßen wichtig ist. Dies war entscheidend für das Überleben der Soldaten.

Im Jahr 1953 bestimmte Francis Crick zusammen mit Rosalind Franklin und James Watson die Struktur der DNA und zeigte, dass sie aus zwei Strängen langer Nukleinsäureketten besteht. Diese bahnbrechende Entdeckung ebnete den Weg für Meselson und Stahl, die in ihrem Experiment von 1958 ein Dichtegradientenzentrifugationsprotokoll zur Isolierung von DNA aus E. coli-Bakterien entwickeln konnten, indem sie die semikonservative Replikation von DNA demonstrierten.

Techniken der Nukleinsäureextraktion

Was sind die 4 Phasen der DNA-Extraktion?
Alle Extraktionsmethoden laufen auf die gleichen grundlegenden Schritte hinaus.

Zellstörung. In diesem Stadium, das auch als Zelllyse bezeichnet wird, wird die Zellwand und/oder die Zellmembran abgebaut, um die intrazellulären Flüssigkeiten freizusetzen, die die gewünschten Nukleinsäuren enthalten.

Entfernung unerwünschter Ablagerungen. Dazu gehören Membranlipide, Proteine ​​und andere unerwünschte Nukleinsäuren, die nachgelagerte Anwendungen beeinträchtigen können.

Isolierung. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die interessierenden Nukleinsäuren aus dem von Ihnen erstellten geklärten Lysat zu isolieren. Diese lassen sich in zwei Hauptkategorien einteilen: lösungsbasiert oder fest (siehe nächster Abschnitt).

Konzentration. Nachdem die Nukleinsäuren von allen anderen Kontaminanten und Verdünnungsmitteln isoliert wurden, werden sie in einem hochkonzentrierten Eluat präsentiert.

Die zwei Arten der Extraktion
Es gibt zwei Arten der Nukleinsäureextraktion: lösungsbasierte Methoden und Festkörpermethoden. Die lösungsbasierte Methode wird auch als chemische Extraktionsmethode bezeichnet, da sie den Einsatz von Chemikalien zum Abbau der Zelle und zum Zugang zum Nukleinmaterial beinhaltet. Dabei können entweder organische Verbindungen wie Phenol und Chloroform oder die weniger schädlichen und daher empfehlenswerteren anorganischen Verbindungen wie Proteinase K oder Kieselgel verwendet werden.

Beispiele für verschiedene chemische Extraktionsmethoden zum Aufschluss einer Zelle sind:

- Osmotisches Aufbrechen der Membran

- Enzymatische Verdauung der Zellwand

- Solubilisierung der Membran

- Mit Reinigungsmitteln

- Mit Alkalibehandlung

Bei Festkörpertechniken, auch mechanische Methoden genannt, wird ausgenutzt, wie DNA mit einem festen Substrat interagiert. Durch die Auswahl einer Perle oder eines Moleküls, an das die DNA bindet, der Analyt jedoch nicht, ist es möglich, die beiden zu trennen. Beispiele für Festphasenextraktionstechniken, einschließlich der Verwendung von Silica und Magnetkügelchen.

Erklärung der magnetischen Perlenextraktion

Die magnetische Perlenextraktionsmethode
Das Potenzial der Extraktion mit Magnetkügelchen wurde erstmals in einem US-Patent erkannt, das Trevor Hawkins für die Forschungseinrichtung Whitehead Institute angemeldet hatte. Dieses Patent bestätigte, dass es möglich sei, genetisches Material zu extrahieren, indem man es an einen festen Träger, bei dem es sich um eine magnetische Perle handeln könnte, bindet. Das Prinzip besteht darin, dass Sie ein hochfunktionalisiertes Magnetkügelchen verwenden, an das sich das genetische Material bindet, das dann vom Überstand getrennt werden kann, indem eine magnetische Kraft auf die Außenseite des Gefäßes mit der Probe ausgeübt wird.

Warum die magnetische Perlenextraktion verwenden?
Die Magnetkügelchen-Extraktionstechnologie erfreut sich immer größerer Beliebtheit, da sie das Potenzial für schnelle und effiziente Extraktionsverfahren bietet. In jüngster Zeit gab es Entwicklungen hochfunktionalisierter magnetischer Beads mit geeigneten Puffersystemen, die eine Automatisierung der Nukleinsäureextraktion und einen sehr ressourcenschonenden und kosteneffizienten Arbeitsablauf ermöglichten. Außerdem beinhalten Extraktionsmethoden mit Magnetkügelchen keine Zentrifugationsschritte, die Scherkräfte verursachen können, die längere DNA-Stücke aufbrechen. Dies bedeutet, dass längere DNA-Stränge intakt bleiben, was bei Genomtests wichtig ist.