So pipettieren Sie kleine Volumina mit manuellen Handpipetten

Da immer mehr Wert auf die Reduzierung von Reagenzien und Kosten gelegt wird, besteht eine hohe Nachfrage nach kleineren Volumina, z. B. für die Herstellung von PCR-Mastermixen oder Enzymreaktionen. Aber das Pipettieren kleiner Volumina von 0,2 – 5 µL stellt neue Herausforderungen an die Pipettiergenauigkeit und -präzision. Folgende Punkte sind wesentlich:

1. Pipetten- und Spitzengröße: Wählen Sie immer die Pipette mit dem kleinstmöglichen Nennvolumen und der kleinsten Spitze, um das Luftpolster möglichst klein zu halten. Wenn Sie beispielsweise 1 µL pipettieren, wählen Sie eine 0,25–2,5 µL-Pipette und die passende Spitze anstelle einer 1–10 µL-Pipette.
2. Kalibrierung und Wartung: Es ist wichtig, dass Ihre Pipetten ordnungsgemäß kalibriert und gewartet werden. Kleine Anpassungen und gebrochene Teile an einer Pipette führen zu einem massiven Anstieg der systematischen und zufälligen Fehlerwerte. Einmal im Jahr muss eine Kalibrierung nach ISO 8655 durchgeführt werden.
3. Direktverdrängerpipetten: Überprüfen Sie, ob Sie in Ihrem Labor eine Direktverdrängerpipette mit einem geringen Volumenbereich haben. Generell führt die Verwendung dieses Pipettentyps zu einem besseren Pipettierergebnis hinsichtlich Genauigkeit und Präzision als mit klassischen Luftpolsterpipetten.
4. Versuchen Sie, größere Volumina zu verwenden: Sie können erwägen, Ihre Probe zu verdünnen, um in der Endreaktion größere Volumina mit der gleichen Menge zu pipettieren. Dadurch können Pipettierfehler bei sehr kleinen Probenvolumina reduziert werden.

Neben einem guten Werkzeug muss der Forscher über eine sehr gute Pipettiertechnik verfügen. Achten Sie besonders auf die folgenden Schritte:

1. Spitzenbefestigung: Klemmen Sie die Pipette nicht auf der Spitze, da dies zu einer Beschädigung des feinen Spitzenendes, einer Umlenkung des Flüssigkeitsstrahls oder einer Beschädigung der Öffnung führen kann. Üben Sie beim Anbringen einer Spitze nur leichten Druck aus und verwenden Sie eine Pipette mit federbelastetem Spitzenkonus.
2. Halten der Pipette: Halten Sie die Pipette nicht in der Hand, während Sie auf die Zentrifuge, den Cycler usw. warten. Das Innere der Pipette erwärmt sich und führt dazu, dass sich das Luftpolster ausdehnt, was zu Abweichungen vom eingestellten Volumen beim Pipettieren führt.
3. Vorbenetzung: Die Befeuchtung der Luft im Inneren der Spitze und Pipette bereitet die Spitze auf die Probe vor und verhindert eine Verdunstung beim Ansaugen des Transfervolumens.
4. Vertikales Ansaugen: Dies ist bei der Handhabung kleiner Volumina sehr wichtig, um den Kapillareffekt zu vermeiden, der auftritt, wenn die Pipette schräg gehalten wird.
5. Eintauchtiefe: Tauchen Sie die Spitze so wenig wie möglich ein, um zu verhindern, dass aufgrund der Kapillarwirkung Flüssigkeit in die Spitze eindringt. Faustregel: Je kleiner Spitze und Volumen, desto geringer die Eintauchtiefe. Beim Pipettieren kleiner Volumina empfehlen wir maximal 2 mm.
6. Abgabe im 45°-Winkel: Ein optimales Abfließen der Flüssigkeit ist gewährleistet, wenn die Pipette im 45°-Winkel gehalten wird.
7. Kontakt mit der Gefäßwand oder der Flüssigkeitsoberfläche: Kleine Volumina können nur dann ordnungsgemäß abgegeben werden, wenn die Spitze an die Gefäßwand gehalten oder in die Flüssigkeit eingetaucht wird. Selbst der letzte Tropfen aus der Spitze kann präzise dosiert werden.
8. Ausblasen: Nach der Abgabe geringer Volumina ist ein Ausblasen zwingend erforderlich, um auch den letzten in der Spitze vorhandenen Flüssigkeitstropfen abzugeben. Das Ausblasen sollte ebenfalls gegen die Gefäßwand erfolgen. Achten Sie beim Ausblasen an der Flüssigkeitsoberfläche darauf, dass keine Luftblasen in die Probe gelangen.