Pipettieren kleiner Mengen mit manuellen Handpipetten

Da die Reduzierung von Reagenzien und Kosten immer mehr im Fokus steht, sind kleinere Volumina gefragt, beispielsweise für die Vorbereitung von PCR-Mastermixen oder Enzymreaktionen. Das Pipettieren kleiner Volumina von 0,2 bis 5 µL stellt jedoch neue Herausforderungen an die Pipettiergenauigkeit und -präzision. Folgende Punkte sind dabei entscheidend:

1. Pipetten- und Spitzengröße: Wählen Sie immer die Pipette mit dem geringstmöglichen Nennvolumen und der kleinsten Spitze, um das Luftpolster so gering wie möglich zu halten. Wählen Sie beispielsweise beim Pipettieren von 1 µL eine 0,25 – 2,5 µL Pipette mit passender Spitze anstelle einer 1 – 10 µL Pipette.
2. Kalibrierung und Wartung: Die ordnungsgemäße Kalibrierung und Wartung Ihrer Pipetten ist unerlässlich. Kleine Justierungen und defekte Teile an einer Pipette führen zu einer massiven Erhöhung der systematischen und zufälligen Fehlerwerte. Eine Kalibrierung nach ISO 8655 muss einmal jährlich durchgeführt werden.
3. Direktverdrängungspipetten: Prüfen Sie, ob Sie in Ihrem Labor eine Direktverdrängungspipette mit niedrigem Volumenbereich haben. Im Allgemeinen führt die Verwendung dieses Pipettentyps zu einem besseren Pipettierergebnis hinsichtlich Genauigkeit und Präzision als mit klassischen Luftpolsterpipetten.
4. Versuchen Sie, größere Volumina zu verwenden: Sie können Ihre Probe verdünnen, um bei gleicher Menge in der Endreaktion größere Volumina zu pipettieren. Dies kann Pipettierfehler bei sehr kleinen Probenvolumina reduzieren.

Neben gutem Werkzeug ist eine gute Pipettiertechnik unerlässlich. Achten Sie besonders auf die folgenden Schritte:

1. Spitzenbefestigung: Die Pipette nicht auf die Spitze drücken, da dies die feine Spitze beschädigen, den Flüssigkeitsstrahl umlenken oder die Öffnung beschädigen kann. Üben Sie beim Aufsetzen der Spitze nur leichten Druck aus und verwenden Sie eine Pipette mit gefedertem Spitzenkonus.
2. Halten der Pipette: Halten Sie die Pipette nicht in der Hand, während Sie auf die Zentrifuge, den Cycler usw. warten. Das Innere der Pipette erwärmt sich und führt zur Ausdehnung des Luftpolsters, was zu Abweichungen vom eingestellten Volumen beim Pipettieren führt.
3. Vorbefeuchtung: Durch die Befeuchtung der Luft im Inneren der Spitze und Pipette wird die Spitze auf die Probe vorbereitet und eine Verdunstung beim Aufsaugen des Transfervolumens vermieden.
4. Vertikale Aspiration: Dies ist beim Umgang mit kleinen Volumina sehr wichtig, um den Kapillareffekt zu vermeiden, der auftritt, wenn die Pipette schräg gehalten wird.
5. Eintauchtiefe: Tauchen Sie die Spitze so wenig wie möglich ein, um zu verhindern, dass Flüssigkeit durch Kapillarwirkung in die Spitze eindringt. Faustregel: Je kleiner Spitze und Volumen, desto geringer die Eintauchtiefe. Beim Pipettieren kleiner Volumina empfehlen wir maximal 2 mm.
6. Abgabe im 45°-Winkel: Ein optimaler Flüssigkeitsausfluss ist gewährleistet, wenn die Pipette in einem 45°-Winkel gehalten wird.
7. Kontakt zur Gefäßwand oder Flüssigkeitsoberfläche: Kleine Mengen können nur dann korrekt dosiert werden, wenn die Spitze an die Gefäßwand gehalten oder in die Flüssigkeit eingetaucht wird. Selbst der letzte Tropfen der Spitze kann präzise dosiert werden.
8. Ausblasen: Nach der Dosierung kleiner Volumina ist ein Ausblasen zwingend erforderlich, um auch den letzten Tropfen Flüssigkeit aus der Spitze zu entfernen. Das Ausblasen sollte ebenfalls gegen die Gefäßwand erfolgen. Achten Sie darauf, dass beim Ausblasen an der Flüssigkeitsoberfläche keine Luftblasen in die Probe gelangen.