For vellykkede amplifikationsreaktioner er det nødvendigt, at de enkelte reaktionskomponenter er til stede i den korrekte koncentration i hvert præparat. Derudover er det vigtigt, at der ikke sker forurening.
Især når mange reaktioner skal opsættes, er det blevet etableret at fremstille en såkaldt mastermix i stedet for at pipettere hvert reagens separat i hver beholder. Prækonfigurerede blandinger er kommercielt tilgængelige, hvor kun prøvespecifikke komponenter (primer) og vand tilsættes. Alternativt kan masterblandingen tilberedes af dig selv. I begge varianter fordeles blandingen til hver PCR-beholder uden skabelon, og den individuelle DNA-prøve tilsættes separat til sidst.
Brug af en mastermix har flere fordele: For det første reduceres antallet af enkelt pipettering. På den måde minimeres både risikoen for brugerfejl under pipettering og risikoen for kontaminering, og der spares naturligvis tid. I princippet er pipetteringsnøjagtigheden også højere, da der doseres større volumener. Dette er let at forstå, når man kontrollerer de tekniske data for pipetter: Jo mindre det doserede volumen er, jo større kan afvigelserne være. Det faktum, at alle præparater kommer fra samme beholder, har en positiv effekt på homogeniteten (hvis det er godt blandet). Dette forbedrer også reproducerbarheden af eksperimenterne.
Ved tilberedning af masterblandingen skal der tilsættes mindst 10 % ekstra volumen (f.eks. hvis der kræves 10 præparater, beregnes på basis af 11), så selv den sidste beholder fyldes ordentligt. På denne måde kan (små) pipeteringsunøjagtigheder og virkningen af prøvetab ved dosering af vaskemiddelholdige opløsninger kompenseres. Rengøringsmidler er indeholdt i enzymopløsninger såsom polymeraser og masterblandinger, hvilket forårsager skumdannelse og rester på den indre overflade af normalpipettespidser.
Afhængigt af applikationen og typen af væske, der skal dispenseres, skal den korrekte pipeteringsteknik (1) vælges og det passende udstyr vælges. Til opløsninger, der indeholder rengøringsmidler, anbefales et direkte forskydningssystem eller de såkaldte "low retention" pipettespidser som et alternativ til luftpudepipetter. Effekten afACE PIPETTE spidser baseret på en særlig hydrofob overflade. Væsker indeholdende rengøringsmidler efterlader ikke en restfilm på inder- og ydersiden, så tabet af opløsning kan minimeres.
Udover den nøjagtige dosering af alle komponenter, er det også vigtigt, at der ikke sker kontaminering af præparaterne. Det er ikke tilstrækkeligt at bruge forbrugsstoffer af høj renhed, fordi pipetteringsprocessen i en luftpudepipette kan producere aerosoler, der forbliver i pipetten. Det DNA, der kan være indeholdt i aerosolen, kan overføres fra en prøve til den næste i det følgende pipeteringstrin og dermed føre til kontaminering. De ovenfor nævnte direkte forskydningssystemer kan også minimere denne risiko. For luftpudepipetter giver det mening at bruge filterspidser til at beskytte pipettekeglen ved at tilbageholde stænk, aerosoler og biomolekyler.
Posttid: Dec-06-2022