For vellykkede amplifikationsreaktioner er det nødvendigt, at de individuelle reaktionskomponenter er til stede i den korrekte koncentration i hvert præparat. Derudover er det vigtigt, at der ikke opstår nogen forurening.
Især når mange reaktioner skal opsættes, er det blevet fastlagt for at fremstille en såkaldt masterblanding i stedet for at pipetter hver reagens separat i hvert fartøj. Forkonfigurerede blandinger er kommercielt tilgængelige, hvor kun prøvespecifikke komponenter (primer) og vand tilsættes. Alternativt kan masterblandingen tilberedes af dig selv. I begge varianter fordeles blandingen til hvert PCR -kar uden en skabelon, og den individuelle DNA -prøve tilsættes separat i slutningen.
Brug af en masterblanding har flere fordele: For det første reduceres antallet af enkeltpipetteringstrin. På denne måde minimeres både risikoen for brugerfejl under pipettering og risikoen for forurening, og selvfølgelig reddes tiden. I princippet er pipetternøjagtigheden også højere, da større mængder er doseret. Dette er let at forstå, når du kontrollerer de tekniske data fra pipetter: jo mindre den doserede volumen, jo højere kan afvigelserne være. Det faktum, at alle præparater kommer fra det samme fartøj, har en positiv effekt på homogenitet (hvis godt blandet). Dette forbedrer også reproducerbarheden af eksperimenterne.
Når man forbereder masterblandingen, skal der tilføjes mindst 10 % ekstra volumen (f.eks. Hvis der kræves 10 præparater, skal du beregne på grundlag af 11), så selv det sidste fartøj fyldes korrekt. På denne måde kan (let) pipettering unøjagtigheder og effekten af prøvetab ved dosering af vaskemiddelholdige løsninger kompenseres. Detergenter er indeholdt i enzymopløsninger såsom polymeraser og masterblandinger, hvilket forårsager skumdannelse og rester på den indre overflade af normalpipette tip.
Afhængig af applikationen og typen af væske, der skal udleveres, skal den korrekte pipetteknik (1) vælges og det passende udstyr, der er valgt. For løsninger, der indeholder vaskemidler, anbefales et direkte forskydelsessystem eller de såkaldte "lave tilbageholdelses" -pipett-tip som et alternativ til air-cushion-pipetter. Virkningen afEss pipette tiper baseret på en særlig hydrofob overflade. Væsker, der indeholder vaskemidler, efterlader ikke en restfilm på indersiden og udvendig, så tabet af opløsning kan minimeres.
Udover den nøjagtige dosering af alle komponenter er det også vigtigt, at der ikke opstår nogen forurening af præparaterne. Det er ikke tilstrækkeligt at bruge forbrugsstoffer med høj renhed, fordi pipetprocessen i en luftpudepipette kan producere aerosoler, der forbliver i pipetten. Det DNA, der kan være indeholdt i aerosolen, kan overføres fra den ene prøve til den næste i det følgende pipettrin og dermed føre til forurening. De ovenfor nævnte direkte forskydningssystemer kan også minimere denne risiko. For pipetter med luft-kudrager er det fornuftigt at bruge filtertips til at beskytte pipetkeglen ved at bevare stænk, aerosoler og biomolekyler.
Posttid: DEC-06-2022