Kryovialerbruges almindeligvis til kryogen opbevaring af cellelinjer og andre kritiske biologiske materialer i dewars fyldt med flydende nitrogen.

Der er flere stadier involveret i den vellykkede bevarelse af celler i flydende nitrogen. Mens grundprincippet er en langsom frysning, afhænger den nøjagtige teknik, der anvendes, af den anvendte celletype og kryobeskyttelsesmiddel. Der er adskillige sikkerhedshensyn og bedste praksis, der skal tages i betragtning, når celler opbevares ved så lave temperaturer.

Dette indlæg har til formål at give et overblik over, hvordan cryovials opbevares i flydende nitrogen.

Hvad er kryovialer

Kryovialer er små hætteglas designet til opbevaring af væskeprøver ved ekstremt lave temperaturer. De sikrer, at celler, der er konserveret i kryobeskyttelsesmiddel, ikke kommer i direkte kontakt med det flydende nitrogen, hvilket minimerer risikoen for cellebrud, mens de stadig nyder godt af den ekstreme køleeffekt af flydende nitrogen.

Hætteglassene er normalt tilgængelige i en række volumener og designs - de kan være indvendigt eller udvendigt gevind med flad eller afrundet bund. Sterile og ikke-sterile formater er også tilgængelige.

Hvem brugerCyrovialerat opbevare celler i flydende nitrogen

En række NHS og private laboratorier samt forskningsinstitutioner, der er specialiseret i navlestrengsblodbank, epitelcellebiologi, immunologi og stamcellebiologi, bruger kryovials til at kryobevare celler.

Celler konserveret på denne måde inkluderer B- og T-celler, CHO-celler, hæmatopoietiske stam- og progenitorceller, hybridomer, tarmceller, makrofager, mesenkymale stam- og progenitorceller, monocytter, myelom, NK-celler og pluripotente stamceller.

Oversigt over hvordan man opbevarer kryovialer i flydende nitrogen

Kryokonservering er en proces, der bevarer celler og andre biologiske konstruktioner ved at afkøle dem til meget lave temperaturer. Celler kan opbevares i flydende nitrogen i årevis uden tab af cellelevedygtighed. Dette er en oversigt over de anvendte procedurer.

Celleforberedelse

Den nøjagtige metode til at forberede prøver vil variere afhængigt af celletypen, men generelt opsamles og centrifugeres cellerne for at udvikle en cellerig pellet. Denne pellet resuspenderes derefter i supernatanten blandet med kryobeskyttelsesmiddel eller et kryokonserveringsmedium.

Kryokonserveringsmedium

Dette medium anvendes til at bevare celler i de lavtemperaturmiljøer, de vil blive udsat for, ved at hæmme dannelsen af ​​intra- og ekstracellulære krystaller og dermed celledød. Deres rolle er at give et sikkert, beskyttende miljø for celler og væv under frysning, opbevaring og optøning.

Et medium såsom frisk frossen plasma (FFP), hepariniseret plasmalytopløsning eller serumfri, animalske komponentfri opløsninger blandes med kryobeskyttelsesmidler såsom dimethylsulfoxid (DMSO) eller glycerol.

Den gen-flydende prøvepellet opdeles i alikvoter i polypropylen kryovials som f.eksSuzhou Ace Biomedicinsk selskab Cryogenic Storage Vials.

Det er vigtigt ikke at overfylde kryovalerne, da dette vil øge risikoen for revner og eventuel frigivelse af indhold (1).

Kontrolleret frysehastighed

Generelt anvendes en langsom kontrolleret frysehastighed til vellykket kryokonservering af celler.

Efter prøverne er fordelt i kryogene hætteglas, anbringes de på våd is eller i et 4℃ køleskab, og frysningsproceduren startes inden for 5 minutter. Som en generel vejledning afkøles celler med en hastighed på -1 til -3 pr. minut (2). Dette opnås ved hjælp af en programmerbar køler eller ved at placere hætteglas i en isoleret boks placeret i en -70°C til -90°C kontrolleret fryser.

Overfør til flydende nitrogen

De frosne kryogene hætteglas overføres derefter til en tank med flydende nitrogen i ubestemte perioder, forudsat at en temperatur på mindre end -135 ℃ opretholdes.

Disse ultralave temperaturer kan opnås ved nedsænkning i væske- eller dampfase-nitrogen.

Væske- eller dampfase?

Opbevaring i flydende nitrogen er kendt for at opretholde den kolde temperatur med absolut konsistens, men anbefales ofte ikke af følgende årsager:

• Behovet for store mængder (dybde) flydende nitrogen, som er en potentiel fare. Forbrændinger eller kvælning på grund af dette er en reel risiko.
• Dokumenterede tilfælde af krydskontaminering med infektionsstoffer som aspergillus, hep B og viral spredning via det flydende nitrogenmedium (2,3)
• Muligheden for, at flydende nitrogen lækker ind i hætteglassene under nedsænkning. Når det fjernes fra lageret og opvarmes til stuetemperatur, udvider nitrogenet sig hurtigt. Følgelig kan hætteglasset splintres, når det fjernes fra opbevaring af flydende nitrogen, hvilket skaber en fare fra både flyvende affald og eksponering for indholdet (1, 4).

Af disse grunde er opbevaring ved ultralav temperatur mest almindeligt i dampfase nitrogen. Når prøver skal opbevares i den flydende fase, skal der anvendes specialiserede cryoflex slanger.

Ulempen ved dampfasen er, at en lodret temperaturgradient kan forekomme, hvilket resulterer i temperatursvingninger mellem -135 ℃ og -190 ℃. Dette nødvendiggør omhyggelig og omhyggelig overvågning af niveauerne af flydende nitrogen og temperaturvariationer (5).

Mange producenter anbefaler, at kryovials er egnede til opbevaring ned til -135 ℃ eller kun til brug i dampfasen.

Optøning af dine kryokonserverede celler

Optøningsproceduren er stressende for en frossen kultur, og korrekt håndtering og teknik er påkrævet for at sikre optimal levedygtighed, genopretning og funktionalitet af cellerne. De nøjagtige optøningsprotokoller vil afhænge af specifikke celletyper. Hurtig optøning anses dog som standard for:

• Reducer enhver indvirkning på cellulær genopretning
• Hjælp med at reducere eksponeringstiden for de opløste stoffer i frysemediet
• Minimer enhver skade ved isrekrystallisation

Vandbade, perlebade eller specialiserede automatiserede instrumenter bruges almindeligvis til at optø prøver.

Oftest optøs 1 cellelinje ad gangen i 1-2 minutter ved forsigtigt at hvirvle i et 37℃ vandbad, indtil der kun er en lille smule is tilbage i hætteglasset, før de vaskes i et forvarmet vækstmedium.

For nogle celler, såsom pattedyrembryoner, er langsom opvarmning afgørende for deres overlevelse.

Cellerne er nu klar til cellekultur, celleisolering eller i tilfælde af hæmatopoietiske stamceller - levedygtighedsundersøgelser for at garantere donorstamcellernes integritet før myeloablativ terapi.

Det er normal praksis at tage små portioner af den forvaskede prøve, der bruges til at udføre en celletælling for at bestemme cellekoncentrationer til udpladning i kultur. Du kan derefter vurdere resultaterne af celleisoleringsprocedurer og bestemme cellelevedygtighed.

Bedste praksis for opbevaring af kryovialer

Den vellykkede kryokonservering af prøver opbevaret i kryovials afhænger af mange elementer i protokollen, herunder korrekt opbevaring og registrering.

• Opdel celler mellem lagerpladser– Hvis volumen tillader det, opdele cellerne mellem hætteglas og opbevare dem på separate steder for at reducere risikoen for prøvetab på grund af udstyrsfejl.
• Undgå krydskontaminering– Vælg sterile kryogene hætteglas til engangsbrug eller autoklav før efterfølgende brug
• Brug passende størrelse hætteglas til dine celler– hætteglas kommer i en række volumener mellem 1 og 5 ml. Undgå overfyldning af hætteglas for at reducere risikoen for revner.
• Vælg indvendige eller udvendige kryogene hætteglas– Indvendigt gevindskårne hætteglas anbefales af nogle universiteter til sikkerhedsforanstaltninger – de kan også forhindre forurening under påfyldning eller ved opbevaring i flydende nitrogen.
• Forebyg lækage- Brug bi-injicerede tætninger støbt ind i skruelåget eller O-ringene for at forhindre lækage og kontaminering.
• Brug 2D stregkoder og etiket hætteglas– for at sikre sporbarhed gør hætteglas med store skrivearealer det muligt for hvert hætteglas at være tilstrækkeligt mærket. 2D-stregkoder kan hjælpe med lagerstyring og registrering. Farvekodede hætter er nyttige for lettere identifikation.
• Tilstrækkelig lagervedligeholdelse- For at sikre, at celler ikke går tabt, bør lagerbeholdere konstant overvåge temperaturen og niveauet af flydende nitrogen. Alarmer bør monteres for at advare brugere om fejl.

Sikkerhedsforanstaltninger

Flydende nitrogen er blevet almindelig praksis i moderne forskning, men medfører risiko for alvorlige skader, hvis det bruges forkert.

Korrekt personlige værnemidler (PPE) bør bæres for at minimere risikoen for forfrysninger, forbrændinger og andre uønskede hændelser ved håndtering af flydende nitrogen. Slid

• Kryogene handsker
• Laboratoriefrakke
• Slagfast fuld ansigtsskærm, der også dækker halsen
• Sko med lukkede tå
• Stænksikkert plastikforklæde

Køleskabe med flydende nitrogen bør placeres i velventilerede områder for at minimere risikoen for kvælning – undsluppet nitrogen fordamper og fortrænger atmosfærisk ilt. Store volumen butikker bør have lav ilt alarmsystemer.

At arbejde i par ved håndtering af flydende nitrogen er ideelt, og dets brug uden for normal arbejdstid bør forbydes.

Kryovialer til at understøtte din arbejdsgang

Suzhou Ace Biomedical virksomhed tilbyder et bredt udvalg af produkter, der opfylder dine behov for kryokonservering for forskellige typer celler. Porteføljen omfatter en række rør såvel som en række sterile kryoglas.

Vores cryovials er:

• Laboratorie-skruelåg 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryoviale kryogene hætteglas Konisk bund kryorør med pakning

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikation, med nederdel eller uden nederdel
  ● Konisk eller selvstående design, sterilt eller ikke-sterilt er begge tilgængelige
  ● Skruelågsrør er lavet af polypropylen af ​​medicinsk kvalitet
  ● PP Cryotube-hætteglas kan fryses og optøs gentagne gange
  ●Det eksterne hættedesign kan reducere forureningssandsynligheden under prøvebehandling.
  ● Kryogenrør med skruelåg Universal skruegevind til brug
  ● Rør passer til de fleste gængse rotorer
  ● Kryogene o-ringrør passer til standard 1-tommer og 2-tommer, 48-brønd, 81-brønd, 96-brønd og 100-brønd frysebokse
  ● Autoklaverbar til 121°C og frysbar til -86°C

  DEL NR	MATERIALE	BIND	KASKETFARVE	PCS/TASKE	TASKER/CASE
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Sort, Gul, Blå, Rød, Lilla, Hvid	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Sort, Gul, Blå, Rød, Lilla, Hvid	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Sort, Gul, Blå, Rød, Lilla, Hvid	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Sort, Gul, Blå, Rød, Lilla, Hvid	500	10