Indledning
Hvad er nukleinsyreekstraktion?
I den meget simpleste vending er nukleinsyreekstraktion fjernelse af RNA og/eller DNA fra en prøve og alt det overskydende, der ikke er nødvendigt. Ekstraktionsprocessen isolerer nukleinsyrerne fra en prøve og giver dem i form af et koncentreret eluat, fri for fortyndingsmidler og kontaminanter, der kan påvirke enhver nedstrøms anvendelse.
Anvendelser af nukleinsyreekstraktion
Oprensede nukleinsyrer bruges i et væld af forskellige anvendelser, der spænder over flere forskellige industrier. Sundhedspleje er måske det område, hvor det bruges mest, med renset RNA og DNA, der kræves til en lang række forskellige testformål.
Anvendelser af nukleinsyreekstraktion i sundhedsvæsenet omfatter:
- Next Generation Sequencing (NGS)
- Amplifikationsbaseret SNP Genotyping
- Array-baseret genotyping
- Restriktion enzymfordøjelse
- Analyser ved hjælp af modificerende enzymer (f.eks. ligering og kloning)
Der er også andre områder ud over sundhedspleje, hvor der anvendes nukleinsyreekstraktion, herunder men ikke begrænset til faderskabstest, retsmedicin og genomik.
En kort historie om nukleinsyreekstraktion
DNA-ekstraktiongår langt tilbage, hvor den første kendte isolation blev udført af en schweizisk læge ved navn Friedrich Miescher i 1869. Miescher håbede på at løse livets grundlæggende principper ved at bestemme cellernes kemiske sammensætning. Efter at have svigtet med lymfocytter, var han i stand til at opnå et råt bundfald af DNA fra leukocytter fundet i pus på kasserede bandager. Han gjorde dette ved at tilføje syre og derefter alkali til cellen for at forlade cellens cytoplasma, og udviklede derefter en protokol til at adskille DNA'et fra de andre proteiner.
Efter Mieschers banebrydende forskning er mange andre videnskabsmænd gået videre med at fremme og udvikle teknikker til at isolere og rense DNA. Edwin Joseph Cohn, en proteinforsker udviklede mange teknikker til proteinrensning under 2. verdenskrig. Han var ansvarlig for at isolere serumalbuminfraktionen i blodplasma, som er vigtig for at opretholde det osmotiske tryk i blodkarrene. Dette var afgørende for at holde soldaterne i live.
I 1953 bestemte Francis Crick sammen med Rosalind Franklin og James Watson strukturen af DNA, hvilket viste, at det bestod af to strenge af lange kæder af nukleinsyrenukleotider. Denne banebrydende opdagelse banede vejen for Meselson og Stahl, som var i stand til at udvikle en tæthedsgradient-centrifugeringsprotokol til at isolere DNA fra E. Coli-bakterier, da de demonstrerede den semi-konservative replikation af DNA under deres 1958-eksperiment.
Teknikker til nukleinsyreekstraktion
Hvad er de 4 stadier af DNA-ekstraktion?
Alle ekstraktionsmetoder koger ned til de samme grundlæggende trin.
Celleforstyrrelse. Dette stadie, også kendt som cellelyse, involverer nedbrydning af cellevæggen og/eller cellemembranen for at frigive de intracellulære væsker, der indeholder nukleinsyrerne af interesse.
Fjernelse af uønsket affald. Dette inkluderer membranlipider, proteiner og andre uønskede nukleinsyrer, som kan interferere med nedstrømsapplikationer.
Isolation. Der er en række forskellige måder at isolere nukleinsyrerne af interesse fra det clearede lysat, du har oprettet, som falder mellem to hovedkategorier: opløsningsbaseret eller fast tilstand (se næste afsnit).
Koncentration. Efter at nukleinsyrerne er blevet isoleret fra alle andre kontaminanter og fortyndingsmidler, præsenteres de i et højkoncentreret eluat.
De to typer ekstraktion
Der er to typer nukleinsyreekstraktion - opløsningsbaserede metoder og faststofmetoder. Den løsningsbaserede metode er også kendt som den kemiske ekstraktionsmetode, da den involverer brug af kemikalier til at nedbryde cellen og få adgang til nukleinmaterialet. Dette kan være at bruge enten organiske forbindelser såsom phenol og chloroform, eller de mindre skadelige og derfor mere anbefalede uorganiske forbindelser såsom Proteinase K eller silicagel.
Eksempler på forskellige kemiske ekstraktionsmetoder til at nedbryde en celle omfatter:
- Osmotisk brud af membran
- Enzymatisk fordøjelse af cellevæg
- Solubilisering af membran
- Med rengøringsmidler
- Med alkalibehandling
Faststofteknikker, også kendt som mekaniske metoder, involverer at udnytte, hvordan DNA interagerer med et fast substrat. Ved at vælge en perle eller et molekyle, som DNA'et vil binde sig til, men analytten ikke vil, er det muligt at adskille de to. Eksempler på fastfase-ekstraktionsteknikker, herunder anvendelse af silica og magnetiske perler.
Magnetisk perleudtrækning forklaret
Den magnetiske perleekstraktionsmetode
Potentialet for ekstraktion ved hjælp af magnetiske perler blev først anerkendt i et amerikansk patent indgivet af Trevor Hawkins, for Whitehead Institute forskningsinstitution. Dette patent anerkendte, at det var muligt at udvinde genetisk materiale ved at binde dem til en fast bærer, som kunne være en magnetisk perle. Princippet er, at man bruger en meget funktionaliseret magnetisk perle, som det genetiske materiale binder sig til, som så kan adskilles fra supernatanten ved at påføre en magnetisk kraft på ydersiden af beholderen, der holder prøven.
Hvorfor bruge magnetisk perleekstraktion?
Magnetisk perleekstraktionsteknologi bliver stadig mere udbredt på grund af det potentiale, det rummer for hurtige og effektive ekstraktionsprocedurer. I nyere tid har der været udviklinger af højt funktionaliserede magnetiske perler med passende buffersystemer, som har muliggjort automatisering af nukleinsyreekstraktion og en arbejdsgang, der er meget ressourcelet og omkostningseffektiv. Også magnetiske perleekstraktionsmetoder involverer ikke de centrifugeringstrin, der kan forårsage forskydningskræfter, som bryder længere DNA-stykker. Det betyder, at længere DNA-strenge forbliver intakte, hvilket er vigtigt i genomisk testning.
Indlægstid: 25. nov. 2022