Er, mewn theori, byddai un moleciwl o'r templed yn ddigonol, defnyddir symiau llawer mwy o DNA yn nodweddiadol ar gyfer PCR clasurol, er enghraifft, hyd at 1 µg o DNA mamalaidd genomig a chyn lleied ag 1 pg o DNA plasmid. Mae'r swm gorau posibl yn dibynnu i raddau helaeth ar nifer y copïau o'r dilyniant targed, yn ogystal ag ar ei gymhlethdod.
Os mai ychydig iawn o dempled a ddefnyddir, bydd angen cynnydd cyfatebol yn nifer y cylchoedd ymhelaethu i gael digon o gynnyrch. Nid yw polymeras taq a ddefnyddir ar gyfer y mwyafrif o arbrofion PCR yn cynnwys swyddogaeth gywiro (gweithgaredd exonuclease 3'-5 ′); Felly, ni ellir cywiro gwallau sy'n digwydd wrth ymhelaethu. Po uchaf yw nifer y cylchoedd, y mwyaf cyffredin fydd ymhelaethu ar gynnyrch diffygiol. Ar y llaw arall, os yw maint y templed yn rhy uchel, bydd y tebygolrwydd y bydd primers yn anelio i ddilyniannau eraill (nid cant y cant yn ganmoliaethus), yn ogystal â ffurfio dimers primer, yn cynyddu, a fydd yn arwain at ymhelaethu sgil-gynhyrchion. Mewn llawer o achosion, mae DNA wedi'i ynysu oddi wrth ddiwylliannau celloedd neu oddi wrth ficro -organebau ac fe'i defnyddir wedi hynny fel templed PCR. Yn dilyn puro, mae angen pennu crynodiad y DNA i allu diffinio'r cyfaint sy'n ofynnol ar gyfer y setup PCR. Er y gall electrofforesis gel agarose ddarparu amcangyfrif, mae'r dull hwn ymhell o fod yn gywir. Mae sbectroffotometreg UV-vis wedi'i sefydlu fel y safon aur ar gyfer meintioli asidau niwclëig; Mae'r dull uniongyrchol ac felly hawdd a chyflym hwn yn mesur amsugnedd y sampl ar 260 nm, a chyfrifir crynodiad gyda chymorth ffactor trosi.
Os yw'r crynodiad DNA yn isel iawn, fodd bynnag (<1 µg/ml dsDNA), neu os yw wedi'i halogi â sylweddau sydd hefyd yn amsugno yn yr ystod 260 nm (ee RNA, protein, halwynau), bydd y dull hwn yn cyrraedd ei gyfyngiadau. Yn achos crynodiadau isel iawn, cyn bo hir bydd y darlleniadau'n mynd yn rhy anghywir i fod o ddefnydd, a bydd halogiadau yn arwain at oramcangyfrif (weithiau enfawr) o'r gwerth gwirioneddol. Yn yr achos hwn, gall meintioli gan ddefnyddio fflwroleuedd gyflwyno dewis arall. Mae'r dechneg hon yn seiliedig ar ddefnyddio llifyn fflwroleuol sy'n clymu'n benodol â dsDNA dim ond y cymhleth sy'n cynnwys asid niwclëig a llifyn sy'n cael ei gyffroi gan y golau, ac wedi hynny bydd yn allyrru golau tonfedd ychydig yn uwch. Yma, mae dwyster y signal fflwroleuol yn gymesur â faint o DNA, ac ar gyfer pennu'r crynodiad mae'n cael ei werthuso mewn perthynas â chromlin safonol. Mae manteision y dull hwn yn dibynnu ar benodolrwydd y bond, sy'n eithrio'r dylanwadau allanol a gyflwynir trwy halogiad, yn ogystal ag ar y gallu sy'n deillio o ganlyniad i ganfod crynodiadau isel iawn o DNA. Mae addasrwydd y naill ddull neu'r llall yn dibynnu'n bennaf ar grynodiad a phurdeb sampl; Mewn llawer o achosion efallai y bydd yn syniad da defnyddio'r ddau ddull yn gyfochrog hyd yn oed.
Amser Post: Tach-30-2022