Er y byddai un moleciwl o’r templed mewn egwyddor yn ddigon, mae symiau sylweddol uwch o DNA yn cael eu defnyddio fel arfer ar gyfer PCR clasurol, er enghraifft, hyd at 1 µg o DNA mamalaidd genomig a chyn lleied ag 1 pg o DNA plasmid. Mae'r swm gorau posibl yn dibynnu i raddau helaeth ar nifer y copïau o'r dilyniant targed, yn ogystal ag ar ei gymhlethdod.
Os mai ychydig iawn o dempled a ddefnyddir, bydd angen cynnydd cyfatebol yn nifer y cylchoedd ymhelaethu i gael swm digonol o gynnyrch. Nid yw polymeras Taq a ddefnyddir ar gyfer y rhan fwyaf o arbrofion PCR yn cynnwys swyddogaeth gywiro (gweithgaredd exonuclease 3′-5′); felly, ni ellir cywiro gwallau sy'n digwydd yn ystod ymhelaethu. Po uchaf yw nifer y cylchoedd, y mwyaf cyffredin fydd ymhelaethu ar gynnyrch diffygiol. Ar y llaw arall, os yw maint y templed yn rhy uchel, bydd y tebygolrwydd y bydd paent preimio yn anelio i ddilyniannau eraill (nid cant y cant yn ganmoliaethus), yn ogystal â ffurfio dimers paent preimio, yn cynyddu, a fydd yn arwain at ymhelaethu ar. sgil-gynhyrchion. Mewn llawer o achosion, mae DNA yn cael ei ynysu o ddiwylliannau celloedd neu o ficro-organebau ac yna'n cael ei ddefnyddio fel templed PCR. Yn dilyn puro, mae angen pennu crynodiad y DNA i allu diffinio'r cyfaint sydd ei angen ar gyfer y gosodiad PCR. Er y gallai electrofforesis gel agarose roi amcangyfrif, nid yw'r dull hwn yn gywir o bell ffordd. Mae sbectrophotometreg UV-Vis wedi'i sefydlu fel y safon aur ar gyfer meintioli asidau niwclëig; mae'r dull uniongyrchol hwn ac felly'n hawdd a chyflym yn mesur amsugnedd y sampl ar 260 nm, ac mae'r crynodiad yn cael ei gyfrifo gyda chymorth ffactor trosi.
Os yw'r crynodiad DNA yn isel iawn, fodd bynnag (< 1 µg/mL dsDNA), neu os yw wedi'i halogi â sylweddau sydd hefyd yn amsugno yn yr ystod 260 nm (ee RNA, protein, halwynau), bydd y dull hwn yn cyrraedd ei gyfyngiadau. Yn achos crynodiadau isel iawn, cyn bo hir bydd y darlleniadau'n mynd yn rhy anghywir i fod o ddefnydd, a bydd halogion yn arwain at oramcangyfrif (aruthrol weithiau) o'r gwerth gwirioneddol. Yn yr achos hwn, gall meintioli gan ddefnyddio fflworoleuedd gyflwyno dewis arall. Mae'r dechneg hon yn seiliedig ar ddefnyddio llifyn fflwroleuol sy'n clymu'n benodol i dsDNA dim ond y cymhleth sy'n cynnwys asid niwclëig a llifyn sy'n cael ei gyffroi gan y golau, a bydd wedyn yn allyrru golau o donfedd ychydig yn uwch. Yma, mae dwyster y signal fflwroleuol yn gymesur â faint o DNA, ac ar gyfer pennu'r crynodiad caiff ei werthuso mewn perthynas â chromlin safonol. Mae manteision y dull hwn yn dibynnu ar benodolrwydd y bond, sy'n eithrio'r dylanwadau allanol a gyflwynir gan halogiad, yn ogystal ag ar y gallu canlyniadol i ganfod crynodiadau isel iawn o DNA. Mae addasrwydd y naill ddull neu'r llall yn dibynnu'n bennaf ar grynodiad a phurdeb sampl; mewn llawer o achosion efallai y byddai hyd yn oed yn ddoeth defnyddio'r ddau ddull ochr yn ochr.
Amser postio: Tachwedd-30-2022