Pro úspěšné amplifikační reakce je nutné, aby jednotlivé složky reakce byly přítomny ve správné koncentraci v každé přípravě. Kromě toho je důležité, aby nedošlo k žádné kontaminaci.
Obzvláště když musí být nastaveno mnoho reakcí, bylo stanoveno, aby se připravila takzvaná hlavní směs namísto pipetování každého činidla samostatně do každé nádoby. Předkonfigurované směsi jsou komerčně dostupné, ve kterých se přidávají pouze komponenty specifické pro vzorky (primer) a voda. Alternativně lze hlavní mix připravit sami. V obou variantách je směs distribuována do každé PCR cévy bez šablony a jednotlivý vzorek DNA se na konci přidá samostatně.
Používání hlavní směsi má několik výhod: zaprvé se sníží počet jednoduchých pipetovacích kroků. Tímto způsobem je minimalizováno riziko chyb uživatele během pipetování a riziko kontaminace a samozřejmě je ušetřen čas. V zásadě je přesnost pipetování také vyšší, protože se podávají větší objemy. To je snadno pochopitelné při kontrole technických údajů pipet: čím menší je dávkovaný objem, tím vyšší mohou být odchylky. Skutečnost, že všechny přípravy pocházejí ze stejné nádoby, má pozitivní vliv na homogenitu (pokud je dobře smíšené). To také zlepšuje reprodukovatelnost experimentů.
Při přípravě hlavní směsi by měl být přidán nejméně 10 % navíc (např. Pokud je vyžadováno 10 přípravků, vypočítejte na základě 11), takže i poslední nádoba správně vyplněná. Tímto způsobem lze kompenzovat (mírné) nepřesnosti pipet a účinek ztráty vzorku při dávkování detergentních roztoků. Detergenty jsou obsaženy v enzymových roztocích, jako jsou polymerázy a hlavní směsi, což způsobuje tvorbu pěny a zbytky na vnitřním povrchu normálníhoPipette tipy.
V závislosti na aplikaci a typu kapaliny, která má být vydána, by měla být vybrána správná technika pipetování (1) a vybrána vhodná zařízení. Pro řešení obsahující detergenty, systém přímého posunu nebo tzv. „Nízké retenční“ pipety jako alternativu pro vzduchové polštáře. ÚčinekTip pipety esoje založen na zvláště hydrofobním povrchu. Kapaliny obsahující detergenty nenechávají zbytkový film uvnitř i vně, takže ztrátu roztoku lze minimalizovat.
Kromě přesného dávkování všech složek je také důležité, aby nedošlo k kontaminaci přípravků. Nestačí používat spotřební materiál s vysokou čistotou, protože proces pipetování v pipetu vzduchového polštáře může produkovat aerosoly, které zůstávají v pipetě. DNA, která může být obsažena v aerosolu, může být přenesena z jednoho vzorku do druhého v následujícím kroku pipety, a tak vést ke kontaminaci. Výše uvedené systémy přímého přemístění mohou také minimalizovat toto riziko. U pipet na vzduchu má smysl používat filtrační špičky k ochraně kužele Pipette zachováním stříkajících, aerosolů a biomolekul.
Čas příspěvku: prosinec-06-2022