Pro úspěšné amplifikační reakce je nutné, aby jednotlivé reakční složky byly v každém preparátu přítomny ve správné koncentraci. Kromě toho je důležité, aby nedošlo ke kontaminaci.
Zejména když je třeba připravit mnoho reakcí, bylo zavedeno připravit takzvanou hlavní směs namísto pipetování každého činidla samostatně do každé nádoby. Komerčně dostupné jsou předem nakonfigurované směsi, do kterých se přidávají pouze složky specifické pro vzorek (primer) a voda. Případně si master mix můžete připravit sami. V obou variantách je směs distribuována do každé PCR nádoby bez templátu a na konci je přidán jednotlivý vzorek DNA samostatně.
Použití master mixu má několik výhod: Za prvé, počet jednotlivých kroků pipetování je snížen. Minimalizuje se tak jak riziko chyb uživatele při pipetování, tak riziko kontaminace a samozřejmě se šetří čas. V zásadě je také přesnost pipetování vyšší, protože se dávkují větší objemy. To je snadno pochopitelné při kontrole technických údajů pipet: Čím menší je dávkovaný objem, tím vyšší mohou být odchylky. Skutečnost, že všechny přípravky pocházejí ze stejné nádoby, má pozitivní vliv na homogenitu (pokud jsou dobře promíchány). To také zlepšuje reprodukovatelnost experimentů.
Při přípravě master mixu je třeba přidat minimálně 10 % objemu navíc (např. pokud je potřeba 10 přípravků, počítejte na základě 11), aby se i poslední nádoba řádně naplnila. Tímto způsobem lze kompenzovat (nepatrné) nepřesnosti pipetování a vliv ztráty vzorku při dávkování roztoků obsahujících detergent. Detergenty jsou obsaženy v enzymových roztocích, jako jsou polymerázy a master mixy, což způsobuje tvorbu pěny a zbytky na vnitřním povrchu normálníšpičky pipet.
V závislosti na aplikaci a typu dávkované kapaliny by měla být zvolena správná technika pipetování (1) a zvoleno vhodné zařízení. Pro roztoky obsahující detergenty se jako alternativa k pipetám se vzduchovým polštářem doporučuje systém přímého vytěsnění nebo takzvané špičky pipet s „nízkým zadržováním“. ÚčinekŠpička ACE PIPETTEje založen na zvláště hydrofobním povrchu. Kapaliny obsahující detergenty nezanechávají uvnitř ani vně zbytkový film, takže ztráta roztoku může být minimalizována.
Kromě přesného dávkování všech složek je také důležité, aby nedocházelo ke kontaminaci přípravků. Nestačí použít spotřební materiál vysoké čistoty, protože proces pipetování v pipetě se vzduchovým polštářem může produkovat aerosoly, které zůstávají v pipetě. DNA, která může být obsažena v aerosolu, může být přenesena z jednoho vzorku do dalšího v následujícím kroku pipetování, a tak vést ke kontaminaci. Výše uvedené systémy přímého posunu mohou toto riziko také minimalizovat. U pipet se vzduchovým polštářem má smysl používat špičky s filtrem k ochraně kužele pipety zadržováním rozstřiků, aerosolů a biomolekul.
Čas odeslání: prosinec-06-2022