Cryovialsse běžně používají pro kryogenní skladování buněčných linií a jiných kritických biologických materiálů v dewary naplněných kapalným dusíkem.

Do úspěšné konzervace buněk v kapalném dusíku je několik fází zapojeno. Zatímco základní princip je pomalý zmrazení, přesná technika použitá závisí na použitém typu buňky a použitém kryoprotektantu. Při skladování buněk při takových nízkých teplotách existuje několik bezpečnostních aspektů a osvědčených postupů.

Cílem tohoto příspěvku je poskytnout přehled o tom, jak jsou kryoviální uloženy v kapalném dusíku.

Co jsou Cryovials

Cryovials jsou malé, limitované lahvičky určené pro ukládání vzorků kapaliny při extrémně nízkých teplotách. Zajišťují, že buňky konzervované v kryoprotektantu nepřicházejí do přímého kontaktu s kapalným dusíkem, což minimalizuje riziko buněčných zlomenin a přitom těží z extrémního chladicího účinku kapalného dusíku.

Lahvičky jsou obvykle k dispozici v řadě objemu a vzorů - mohou být interně nebo externě navléčeny plochými nebo zaoblenými dna. K dispozici jsou také sterilní a nesterilní formáty.

Kdo používáCyrovialsUkládat buňky do kapalného dusíku

Řada NHS a soukromých laboratoří, jakož i výzkumné instituce specializující se na bankovnictví pupečníkové krve, biologii epiteliálních buněk, imunologie a biologie kmenových buněk používají kryoviální buňky.

Buňky konzervované tímto způsobem zahrnují B a T buňky, CHO buňky, hematopoetické kmenové a progenitorové buňky, hybridomy, střevní buňky, makrofágy, mezenchymální kmenové a progenitorové buňky, monocyty, myelom, NK buňky a pluripotentní kmenové buňky.

Přehled o tom, jak ukládat kryovials v tekutém dusíku

Kryokonzervace je proces, který zachovává buňky a další biologické konstrukty jejich chlazením na velmi nízké teploty. Buňky mohou být uloženy v kapalném dusíku po celá léta bez ztráty životaschopnosti buněk. Toto je obrys použitých postupů.

Příprava buněk

Přesná metoda přípravy vzorků se bude lišit v závislosti na typu buňky, ale obecně se buňky shromažďují a odstředěny, aby se vyvinula peleta bohatá na buňky. Tato peleta je poté resuspendována v supernatantu smíchaném s kryoprotektantem nebo kryokonzervačním médiem.

Kryokonzervační médium

Toto médium se používá k zachování buněk v prostředí s nízkou teplotou, kterým budou podrobeny inhibicí tvorby uvnitř a extracelulárních krystalů a tedy i buněčné smrti. Jejich úlohou je poskytovat bezpečné, ochranné prostředí pro buňky a tkáně během procesů mrazu, skladování a rozmrazování.

Médium, jako je čerstvá zmrazená plazma (FFP), heparinizovaný roztok plazmalytu nebo roztoky bez sérových složek bez zvířat, se mísí s kryoprotektanty, jako je dimethylsulfoxid (DMSO) nebo glycerol.

Re-likvidovaná vzorková peleta je alikvována do polypropylenových kryoviálních, jako napříkladSuzhou Ace Biomedicínská společnost kryogenní úložné lahvičky.

Je důležité nepřeplnit kryovials, protože to zvýší riziko praskání a možné uvolnění obsahu (1).

Kontrolovaná míra mrazu

Obecně se pro úspěšnou kryokonzervaci buněk používá pomalu kontrolovaná rychlost mrazu.

Poté, co jsou vzorky alikvovány do kryogenních lahviček, jsou umístěny na mokrým ledu nebo do ledničky 4 ℃ a postup zmrazení je zahájen do 5 minut. Jako obecný průvodce jsou buňky ochlazeny rychlostí -1 až -3 za minutu (2). Toho je dosaženo za použití programovatelného chladiče nebo umístěním lahviček do izolované krabice umístěné do –70 ° C až –90 ° C.

Přenos do kapalného dusíku

Zmrazené kryogenní lahvičky se poté přenesou do kapalného dusíkového nádrže po dobu neurčitou za předpokladu, že je udržována teplota menší než -135 ℃.

Tyto ultra nízké teploty lze získat ponořením do dusíku kapaliny nebo páry.

Kapalina nebo pára?

Je známo, že skladování v kapalné fázi dusíku udržuje chladnou teplotu s absolutní konzistencí, ale často se nedoporučuje z následujících důvodů:

• Potřeba velkých objemu (hloubky) kapalného dusíku, což je potenciální nebezpečí. Popálení nebo asfyxiace je skutečné riziko.
• Zdokumentované případy křížové kontaminace infekčními látkami, jako je Aspergillus, Hep B a virové šíření prostřednictvím kapalného dusíkového média (2,3)
• Potenciál, aby kapalný dusík pronikl do lahviček během ponoření. Když se dusík odstraní z skladování a zahřátý na pokojovou teplotu, rychle se rozšiřuje. V důsledku toho se může lahvička rozbít, když se odstraní z kapalného skladování dusíku, což způsobí nebezpečí jak z létajících zbytků, tak z vystavení obsahu (1, 4).

Z těchto důvodů je ultra nízké skladování teploty nejčastěji v dusíku páry. Pokud musí být vzorky uloženy v kapalné fázi, měla by být použita specializovaná kryoflexní trubice.

Nevýhodou fáze par je, že může dojít k vertikální teplotní gradient, což má za následek kolísání teploty mezi -135 ℃ a -190 ℃. To vyžaduje pečlivé a pečlivé sledování hladin kapalného dusíku a změny teploty (5).

Mnoho výrobců doporučuje, aby Cryovials byly vhodné pro skladování až do -135 ℃ nebo pro použití pouze ve fázi páry.

Rozmrazení vašich kryokonzervovaných buněk

Procedura tání je stresující pro zmrazenou kulturu a pro zajištění optimální životaschopnosti, zotavení a funkčnosti buněk je nutná správná manipulace a technika. Přesné protokoly rozmrazování budou záviset na specifických typech buněk. Rychlé rozmrazení je však považováno za standardní pro:

• Snižte jakýkoli dopad na regeneraci buněk
• Pomozte zkrátit dobu expozice soluty přítomným v mrazivých médiích
• Minimalizujte jakékoli poškození rekrystalizací ledu

K vytáčení vzorků se běžně používají vodní lázně, korálky nebo specializované automatizované nástroje.

Nejčastěji 1 buněčná linie je rozmrazena najednou po dobu 1-2 minut, jemně vířením ve 37 ℃ vodní lázni, dokud v lahvičce zbývá jen malý led, než se omyje do přehnaného růstového média.

U některých buněk, jako jsou savčí embrya, je pro jejich přežití nezbytné pomalé oteplování.

Buňky jsou nyní připraveny na buněčnou kulturu, izolaci buněk nebo v případě hematopoetických kmenových buněk - studie životaschopnosti, které zaručují integritu dárcovských kmenových buněk před myeloablativní terapií.

Je normální praxí užívat malé alikvoty předloženého vzorku používaného k provedení počtu buněk pro stanovení koncentrací buněk pro pokovování v kultuře. Poté můžete posoudit výsledky postupů izolace buněk a stanovit životaschopnost buněk.

Osvědčené postupy pro skladování kryovials

Úspěšná kryokonzervace vzorků uložených v Cryovials závisí na mnoha prvcích v protokolu včetně správného ukládání a vedení záznamů.

• Rozdělit buňky mezi skladovacími místy- Pokud to dovolí objemy, rozdělujte buňky mezi lahvičky a uložte je na samostatných místech, aby se snížilo riziko ztráty vzorku v důsledku selhání zařízení.
• Zabránit křížové kontaminaci-Před následným použitím se rozhodněte pro sterilní kryogenní lahvičky nebo autoklávu s jedním použitím.
• Pro vaše buňky použijte lahvičky shodnými velikostmi- Vials přicházejí v řadě objemu mezi 1 a 5 ml. Vyvarujte se nadměrného vyplňování lahviček, abyste snížili riziko praskání.
• Vyberte vnitřní nebo externě navlécené kryogenní lahvičky- Některé univerzity doporučují vnitřně závitové lahvičky pro bezpečnostní opatření - mohou také zabránit kontaminaci během plnění nebo při skladování v kapalném dusíku.
• Zabránit úniku-Použijte těsnění injektované BI formované do šroubovacích nebo O-kroužků, abyste zabránili úniku a kontaminaci.
• Použijte 2D čárové kódy a latici- Pro zajištění sledovatelnosti umožňují lahvičky s velkými oblastmi psaní adekvátní označení. 2D čárové kódy mohou pomoci s řízením úložiště a vedením záznamů. Pro snazší identifikaci jsou užitečné barevné kódované uzávěry.
• Přiměřená údržba úložiště- Aby se zajistilo, že se buňky neztratí, měly by skladovací nádoby neustále sledovat hladinu teploty a kapalného dusíku. Alarmy by měly být namontovány tak, aby upozornily uživatele na chyby.

Bezpečnostní opatření

Kapalný dusík se stal běžnou praxí v moderním výzkumu, ale při nesprávném používání je riziko vážného zranění.

Správné osobní ochranné prostředky (PPE) by se mělo při manipulaci s tekutým dusíkem nosit, aby se minimalizovalo riziko omrzliny, popálenin a dalších nepříznivých incidentů. Nosit

• Kryogenní rukavice
• Laboratorní kabát
• Odolný odolný proti obličeji, který také pokrývá krk
• Boty s uzavřenou nohou
• Splashproof Plastic Apron

Kapalné chladničky dusíku by měly být umístěny do dobře větraných oblastí, aby se minimalizovalo riziko asfyxiace-unikl dusíku odpařených a vysídlených atmosférickým kyslíkem. Velké objemové obchody by měly mít nízké kyslíkové poplachové systémy.

Práce ve dvojicích při manipulaci s tekutým dusíkem je ideální a jeho použití mimo normální pracovní dobu by mělo být zakázáno.

Cryovials na podporu vašeho pracovního postupu

Biomedicínské společnosti Suzhou Ace nabízí široký výběr produktů, které splňují vaše kryokonzervační potřeby pro různé typy buněk. Portfolio zahrnuje řadu trubek a řadu sterilních kryoviálních.

Naše Cryovials jsou:

• Laboratorní šroubová čepice 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryoviální kryogenní lahvičky kónické spodní kryotube s těsněním

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikace, se sukní nebo bez sukně
  ● K dispozici jsou kónický nebo samostatný design, sterilní nebo nesterilní
  ● Trubky šroubového víčka jsou vyrobeny z polypropylenu lékařské třídy
  ● PP Cryotube lahvičky lze opakovaně zamrznout a rozmrazit
  ● Vnější konstrukce Cap může snížit pravděpodobnost kontaminace během ošetření vzorku.
  ● Kryogenní trubice šroubování uzávěrky Univerzální šroubové závity
  ● Trubky odpovídají nejběžnějším rotorům
  ● Kryogenní trubice O-kroužku trubice se hodí standardní 1 palce a 2 palce, 48well, 81well ， 96well a 100well mrazničky
  ● Autoclavavabilní na 121 ° C a zmrazení na -86 ° C

  Část č	MATERIÁL	OBJEM	VÍČKOBARVA	PCS/TAŠKA	Tašky/pouzdro
  ACT05-Bl-N	PP	0,5 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10
  ACT15-Bl-N	PP	1,5 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10
  ACT15-Bl-NW	PP	1,5 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10
  ACT20-Bl-N	PP	2,0 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10