Kryozkumavkyse běžně používají pro kryogenní skladování buněčných linií a jiných kritických biologických materiálů v Dewarových nádobách naplněných kapalným dusíkem.

Existuje několik fází, které se účastní úspěšného uchování buněk v kapalném dusíku. Zatímco základním principem je pomalé zmrazování, přesná použitá technika závisí na typu buňky a použitém kryoprotektantu. Při skladování článků při takto nízkých teplotách je třeba vzít v úvahu několik bezpečnostních aspektů a osvědčených postupů.

Tento příspěvek si klade za cíl poskytnout přehled o tom, jak jsou kryozkumavky skladovány v kapalném dusíku.

Co jsou Cryovials

Kryviolky jsou malé lahvičky s uzávěrem určené pro skladování kapalných vzorků při extrémně nízkých teplotách. Zajišťují, že buňky konzervované v kryoprotektantu nepřijdou do přímého kontaktu s kapalným dusíkem, čímž se minimalizuje riziko buněčných fraktur a přitom stále těží z extrémního chladicího účinku kapalného dusíku.

Lahvičky jsou obvykle dostupné v řadě objemů a provedení – mohou mít vnitřní nebo vnější závit s plochým nebo zaobleným dnem. K dispozici jsou také sterilní a nesterilní formáty.

Kdo používáCyrovialsukládat buňky v kapalném dusíku

Řada NHS a soukromých laboratoří, stejně jako výzkumné instituce specializující se na bankovnictví pupečníkové krve, biologii epiteliálních buněk, imunologii a biologii kmenových buněk, používají kryozkumavky ke kryokonzervaci buněk.

Buňky konzervované tímto způsobem zahrnují B a T buňky, CHO buňky, hematopoetické kmenové a progenitorové buňky, hybridomy, střevní buňky, makrofágy, mezenchymální kmenové a progenitorové buňky, monocyty, myelom, NK buňky a pluripotentní kmenové buňky.

Přehled toho, jak uchovávat kryozkumavky v kapalném dusíku

Kryokonzervace je proces, který uchovává buňky a další biologické konstrukty jejich ochlazením na velmi nízké teploty. Buňky mohou být skladovány v kapalném dusíku roky bez ztráty životaschopnosti buněk. Toto je nástin používaných postupů.

Příprava buněk

Přesný způsob přípravy vzorků se bude lišit v závislosti na typu buněk, ale obecně se buňky shromáždí a odstředí, aby se vytvořila peleta bohatá na buňky. Tato peleta je poté resuspendována v supernatantu smíchaném s kryoprotektantem nebo kryokonzervačním médiem.

Kryokonzervační médium

Toto médium se používá k uchování buněk v nízkoteplotních prostředích, kterým budou vystaveny, inhibicí tvorby intracelulárních a extracelulárních krystalů a tím buněčné smrti. Jejich úlohou je poskytovat bezpečné, ochranné prostředí pro buňky a tkáně během procesů zmrazování, skladování a rozmrazování.

Médium, jako je čerstvě zmrazená plazma (FFP), heparinizovaný roztok plazmalytu nebo roztoky bez séra, bez živočišných složek, se smíchá s kryoprotektivy, jako je dimethylsulfoxid (DMSO) nebo glycerol.

Znovu zkapalněný vzorek pelety se alikvotuje do polypropylenových kryozkumavek, jako je napřSpolečnost Suzhou Ace Biomedical Cryogenic Storage Vials.

Je důležité nepřeplňovat kryozkumavky, protože to zvýší riziko prasknutí a možného uvolnění obsahu (1).

Řízená rychlost zmrazování

Obecně se pro úspěšnou kryokonzervaci buněk používá pomalá kontrolovaná rychlost zmrazování.

Poté, co jsou vzorky rozděleny do alikvotů do kryogenních lahviček, umístí se na mokrý led nebo do chladničky při teplotě 4 °C a během 5 minut se zahájí proces zmrazování. Obecně platí, že buňky jsou ochlazovány rychlostí -1 až -3 za minutu (2). Toho je dosaženo pomocí programovatelného chladiče nebo umístěním lahviček do izolovaného boxu umístěného v mrazáku s řízenou rychlostí –70 °C až –90 °C.

Převod do kapalného dusíku

Zmrazené kryogenní lahvičky se pak přemístí do nádrže s kapalným dusíkem na neurčitou dobu za předpokladu, že je udržována teplota nižší než -135 °C.

Tyto ultranízké teploty lze dosáhnout ponořením do kapalného nebo plynného dusíku.

Kapalná nebo parní fáze?

Je známo, že skladování v kapalném dusíku udržuje nízkou teplotu s absolutní konzistencí, ale často se nedoporučuje z následujících důvodů:

• Potřeba velkých objemů (hloubka) kapalného dusíku, což je potenciální nebezpečí. Popálení nebo udušení v důsledku toho je skutečným rizikem.
• Dokumentované případy křížové kontaminace infekčními agens, jako je aspergillus, hep B a virové šíření prostřednictvím média s tekutým dusíkem (2,3)
• Možnost úniku kapalného dusíku do lahviček během ponoření. Po vyjmutí ze skladu a zahřátí na pokojovou teplotu dusík rychle expanduje. Následkem toho se lahvička může rozbít, když je vyjmuta ze skladu kapalného dusíku, což představuje nebezpečí jak od létajících úlomků, tak od vystavení obsahu (1, 4).

Z těchto důvodů je skladování při ultranízké teplotě nejčastěji v dusíku v plynné fázi. Pokud musí být vzorky skladovány v kapalné fázi, měly by být použity speciální kryoflexní hadičky.

Nevýhodou plynné fáze je, že může nastat vertikální teplotní gradient, který má za následek kolísání teploty mezi -135 °C a -190 °C. To vyžaduje pečlivé a pečlivé sledování hladin kapalného dusíku a teplotních změn (5).

Mnoho výrobců doporučuje, aby byly kryozkumavky vhodné pro skladování až do -135℃ nebo pro použití pouze v parní fázi.

Rozmrazování vašich kryokonzervovaných buněk

Postup rozmrazování je pro zmrazenou kulturu stresující a pro zajištění optimální životaschopnosti, obnovy a funkčnosti buněk je vyžadována správná manipulace a technika. Přesné protokoly rozmrazování budou záviset na konkrétních typech buněk. Rychlé rozmrazování se však považuje za standardní pro:

• Snižte jakýkoli dopad na buněčnou obnovu
• Pomozte zkrátit dobu expozice rozpuštěným látkám přítomným v mrazicím médiu
• Minimalizujte jakékoli poškození rekrystalizací ledu

K rozmrazování vzorků se běžně používají vodní lázně, perličkové lázně nebo specializované automatické přístroje.

Nejčastěji se 1 buněčná linie rozmrazuje najednou po dobu 1-2 minut jemným kroužením ve vodní lázni o teplotě 37 °C, dokud v lahvičce nezůstane jen malý kousek ledu, než se promyjí v předehřátém růstovém médiu.

Pro některé buňky, jako jsou savčí embrya, je pomalé zahřívání nezbytné pro jejich přežití.

Buňky jsou nyní připraveny pro buněčnou kultivaci, buněčnou izolaci nebo v případě hematopoetických kmenových buněk – studie životaschopnosti, aby byla zaručena integrita dárcovských kmenových buněk před myeloablativní terapií.

Je běžnou praxí odebírat malé alikvoty předem promytého vzorku použitého k počítání buněk za účelem stanovení koncentrace buněk pro nanesení do kultury. Poté můžete posoudit výsledky postupů izolace buněk a určit životaschopnost buněk.

Osvědčené postupy pro skladování kryozkumavek

Úspěšná kryokonzervace vzorků uložených v kryozkumavkách závisí na mnoha prvcích v protokolu, včetně správného skladování a vedení záznamů.

• Rozdělte buňky mezi úložná místa– Pokud to objemy umožňují, rozdělte buňky mezi lahvičky a uložte je na oddělená místa, abyste snížili riziko ztráty vzorku v důsledku selhání zařízení.
• Zabraňte křížové kontaminaci– Před dalším použitím zvolte sterilní kryogenní lahvičky na jedno použití nebo autokláv
• Pro vaše buňky použijte lahvičky odpovídající velikosti– lahvičky se dodávají v rozsahu objemů mezi 1 a 5 ml. Vyhněte se přeplnění lahviček, abyste snížili riziko prasknutí.
• Vyberte kryogenní lahvičky s vnitřním nebo vnějším závitem– Lahvičky s vnitřním závitem doporučují některé univerzity pro bezpečnostní opatření – mohou také zabránit kontaminaci při plnění nebo při skladování v kapalném dusíku.
• Zabraňte úniku- Použijte dvouvstřikovaná těsnění zalisovaná do šroubovacího uzávěru nebo O-kroužků, abyste zabránili úniku a kontaminaci.
• Používejte 2D čárové kódy a lahvičky se štítky– pro zajištění sledovatelnosti umožňují lahvičky s velkými plochami pro psaní, aby byla každá lahvička náležitě označena. 2D čárové kódy mohou pomoci se správou úložiště a vedením záznamů. Barevně kódované uzávěry jsou užitečné pro snadnější identifikaci.
• Přiměřená údržba úložiště- Aby se zajistilo, že nedojde ke ztrátě buněk, měly by skladovací nádoby neustále monitorovat teplotu a hladinu kapalného dusíku. Měly by být instalovány alarmy, které uživatele upozorní na chyby.

Bezpečnostní opatření

Kapalný dusík se stal běžnou praxí v moderním výzkumu, ale při nesprávném použití s ​​sebou nese riziko vážného zranění.

Při manipulaci s kapalným dusíkem by se měly používat vhodné osobní ochranné prostředky (OOP), aby se minimalizovalo riziko omrzlin, popálenin a jiných nepříznivých událostí. Nosit

• Kryogenní rukavice
• Laboratorní plášť
• Celoobličejový štít odolný proti nárazu, který zakrývá i krk
• Boty s uzavřenou špičkou
• Plastová zástěra odolná proti stříkající vodě

Chladničky s tekutým dusíkem by měly být umístěny v dobře větraných prostorách, aby se minimalizovalo riziko udušení – uniklý dusík se odpařuje a vytlačuje vzdušný kyslík. Velkoobjemové sklady by měly mít poplašné systémy s nízkým obsahem kyslíku.

Ideální je práce ve dvojicích při manipulaci s kapalným dusíkem a jeho použití mimo běžnou pracovní dobu by mělo být zakázáno.

Kryoviky pro podporu vašeho pracovního postupu

Společnost Suzhou Ace Biomedical nabízí široký výběr produktů, které splňují vaše potřeby kryokonzervace pro různé typy buněk. Portfolio zahrnuje řadu zkumavek a také řadu sterilních kryozkumavek.

Naše kryozkumavky jsou:

• Laboratorní šroubovací uzávěr 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Kryoviální kryogenní lahvičky Kryotuba s kónickým dnem a těsněním

  ● Specifikace 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, se sukní nebo bez sukně
  ● K dispozici jsou kónické nebo samostatně stojící provedení, sterilní nebo nesterilní
  ● Trubky se šroubovacím uzávěrem jsou vyrobeny z lékařského polypropylenu
  ● Lahvičky PP Cryotube lze opakovaně zmrazovat a rozmrazovat
  ●Vnější provedení uzávěru může snížit pravděpodobnost kontaminace během úpravy vzorku.
  ● Kryogenní zkumavky se šroubovacím uzávěrem Univerzální šroubovací závity pro použití
  ● Trubky pasují na většinu běžných rotorů
  ● O-kroužky pro kryogenní trubice se hodí do standardních 1palcových a 2palcových, 48jamkových, 81jamkových, 96jamkových a 100jamkových mrazicích boxů
  ● Autoklávovatelné do 121°C a zmrazitelné na -86°C

  ČÁST Č	MATERIÁL	OBJEM	VÍČKOBARVA	PCS/TAŠKA	TAŠKY/POUZDRO
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Černá, žlutá, modrá, červená, fialová, bílá	500	10