Standardizace procesů zahrnuje jejich optimalizaci a následné nastavení a harmonizaci, umožňující dlouhodobě optimální výkon – nezávisle na uživateli. Standardizace zajišťuje vysoce kvalitní výsledky a také jejich reprodukovatelnost a srovnatelnost.
Cílem (klasické) PCR je generování spolehlivého a reprodukovatelného výsledku. Pro určité aplikace je výtěžekPCR produktje také relevantní. U těchto reakcí je třeba dbát na to, aby vzorky nebyly ohroženy a aby pracovní postup PCR zůstal stabilní. Konkrétně to znamená minimalizaci vnesení kontaminací, které by mohly vést k falešně pozitivním nebo falešně negativním výsledkům nebo dokonce inhibovat reakci PCR. Dále by reakční podmínky měly být pokud možno totožné pro každý jednotlivý vzorek v rámci cyklu a také by měly být přenositelné na následné reakce (stejné metody). To se týká složení reakcí a také typu řízení teploty v cykléru. Uživatelským chybám je samozřejmě třeba se co nejvíce vyhnout.
Níže předvedeme výzvy, se kterými se setkáváme během přípravy a průběhu PCR – a přístupy k řešením, která existují s ohledem na nástroje a spotřební materiál používaný pro standardizaci pracovních postupů PCR.
Příprava reakce
Dávkování reakčních složek do PCR nádob, respektive destiček, zahrnuje řadu problémů, které je třeba překonat:
Reakční podmínky
Přesné a přesné dávkování jednotlivých složek je nepostradatelné při snaze o co nejtotožnější reakční podmínky. Kromě dobré techniky pipetování je rozhodující výběr správného nástroje. PCR master-mixy často obsahují látky, které zvyšují viskozitu nebo vytvářejí pěnu. Během procesu pipetování vedou k podstatnému smáčeníšpičky pipet, čímž se snižuje přesnost pipetování. Použití systémů přímého dávkování nebo alternativních špiček pipet, které jsou méně náchylné ke smáčení, může zlepšit přesnost a preciznost procesu pipetování.
Kontaminace
Během procesu dávkování se vytvářejí aerosoly, které, pokud se jim umožní dostat se dovnitř pipety, mohou potenciálně kontaminovat další vzorek během dalšího pipetovacího kroku. Tomu lze předejít použitím filtračních špiček nebo systémů přímého vytlačování.
Spotřební materiál jako napřtipy, nádoby a destičky, které se používají v pracovním postupu PCR, nesmí obsahovat látky, které ohrožují vzorek nebo falšují výsledek. Patří mezi ně DNA, DNázy, RNázy a inhibitory PCR, stejně jako složky, které se mohou z materiálu během reakce potenciálně vyluhovat – látky známé jako vyluhovatelné.
Chyba uživatele
Čím více vzorků je zpracováno, tím vyšší je riziko chyby. Snadno se může stát, že je vzorek napipetován do nesprávné nádobky nebo nesprávné jamky. Toto riziko lze výrazně snížit snadno rozpoznatelným značením jamek. Automatizací dávkovacích kroků je minimalizován „lidský faktor“, tj. chyby a změny související s uživatelem, čímž se zvyšuje reprodukovatelnost, zejména v případě malých reakčních objemů. To vyžaduje, aby byly v pracovní stanici použity desky s dostatečnou rozměrovou stabilitou. Připojené čárové kódy poskytují další strojovou čitelnost, což zjednodušuje sledování vzorku během celého procesu.
Programování termocykleru
Programování přístroje se může ukázat jako časově náročné a také náchylné k chybám. Různé funkce termocykleru PCR spolupracují, aby tento krok procesu zjednodušily, a co je nejdůležitější, aby byl bezpečný:
Snadné ovládání a dobré vedení uživatele jsou základem efektivního programování. Na tomto základě bude administrace uživatelů chráněná heslem bránit tomu, aby byly vlastní programy měněny jinými uživateli. Pokud se používá více cyklerů (stejného typu), je výhodné, pokud lze program přenášet přímo z jednoho nástroje do druhého přes USB nebo konektivitu. Počítačový software umožňuje centrální a bezpečnou správu programů, uživatelských práv a dokumentů na počítači.
běh PCR
Během běhu je DNA amplifikována v reakční nádobě, kde by měl být každý vzorek podroben identickým, konzistentním reakčním podmínkám. Pro proces jsou relevantní následující aspekty:
Regulace teploty
Vynikající přesnost regulace teploty a homogenita bloku cyklovače jsou základem pro rovnoměrné temperování všech vzorků. Vysoká kvalita topných a chladicích prvků (peltierových prvků), stejně jako způsob jejich připojení k bloku, jsou rozhodujícími faktory, které určují riziko teplotních rozdílů známých jako „edge effect“
Vypařování
Koncentrace jednotlivých reakčních složek by se neměly v průběhu reakce měnit v důsledku odpařování. Jinak je možné, že velmi máloPCR produktmůže být generován nebo vůbec žádný. Je proto zásadní minimalizovat odpařování zajištěním bezpečného utěsnění. V tomto případě vyhřívané víko termocykleru a těsnění nádoby pracují ruku v ruce. K dispozici jsou různé možnosti těsněníPCR destičky (odkaz: Pečetící článek), přičemž nejlepšího utěsnění je dosaženo tepelným utěsněním. Vhodné mohou být i jiné uzávěry, pokud lze přítlak víka cyklovače přizpůsobit zvolenému těsnění.
Standardizace procesů je zavedena, aby byly dlouhodobě zajištěny přesné a reprodukovatelné výsledky. To zahrnuje pravidelnou údržbu zařízení, aby bylo zajištěno, že bude vždy v dobrém provozním stavu. Veškerý spotřební materiál by měl mít trvale vysokou kvalitu ve všech vyráběných sériích a musí být zaručena jejich spolehlivá dostupnost.
Čas odeslání: 29. listopadu 2022