Zavedení
Co je extrakce nukleových kyselin?
Velmi jednoduše řečeno, extrakce nukleové kyseliny je odstranění RNA a/nebo DNA ze vzorku a veškerého přebytku, který není nutný. Proces extrakce izoluje nukleové kyseliny ze vzorku a poskytuje je ve formě koncentrovaného eluátu, bez ředidel a kontaminantů, které by mohly ovlivnit jakékoli následné aplikace.
Aplikace extrakce nukleových kyselin
Purifikované nukleové kyseliny se používají v nepřeberném množství různých aplikací, které se pohybují v mnoha různých odvětvích. Zdravotní péče je možná oblastí, kde se používá nejvíce, přičemž purifikovaná RNA a DNA jsou vyžadovány pro řadu různých různých testovacích účelů.
Aplikace extrakce nukleových kyselin ve zdravotnictví zahrnují:
- sekvenování nové generace (NGS)
- Genotypování SNP založené na amplifikaci
- Genotypování založené na poli
- Omezení trávení enzymů
- Analýzy pomocí modifikujících enzymů (např. ligace a klonování)
Existují také další oblasti mimo zdravotnictví, kde se extrakce nukleových kyselin používá, včetně mimo jiné testování otcovství, forenzní vědy a genomiky.
Stručná historie extrakce nukleových kyselin
Extrakce DNAsahá daleko do minulosti, přičemž první známá izolace byla provedena švýcarským lékařem Friedrichem Miescherem v roce 1869. Miescher doufal, že vyřeší základní principy života stanovením chemického složení buněk. Po selhání s lymfocyty se mu podařilo získat hrubou sraženinu DNA z leukocytů nalezených v hnisu na odhozených obvazech. Udělal to přidáním kyseliny a poté alkálie do buňky, aby opustil buněčnou cytoplazmu, a poté vyvinul protokol k oddělení DNA od ostatních proteinů.
Po Miescherově průkopnickém výzkumu mnoho dalších vědců pokračovalo v pokroku a vývoji technik pro izolaci a čištění DNA. Edwin Joseph Cohn, proteinový vědec vyvinul mnoho technik pro čištění proteinů během 2. světové války. Byl zodpovědný za izolaci frakce sérového albuminu z krevní plazmy, která je důležitá pro udržení osmotického tlaku v cévách. To bylo klíčové pro udržení vojáků naživu.
V roce 1953 Francis Crick spolu s Rosalind Franklinovou a Jamesem Watsonem určil strukturu DNA a ukázal, že se skládá ze dvou řetězců dlouhých řetězců nukleotidů nukleových kyselin. Tento průlomový objev vydláždil cestu Meselsonovi a Stahlovi, kteří byli schopni vyvinout centrifugační protokol s hustotním gradientem k izolaci DNA z bakterií E. Coli, když během svého experimentu v roce 1958 prokázali semikonzervativní replikaci DNA.
Techniky extrakce nukleových kyselin
Jaké jsou 4 fáze extrakce DNA?
Všechny extrakční metody se scvrkají na stejné základní kroky.
Narušení buněk. Toto stadium, také známé jako buněčná lýza, zahrnuje rozbití buněčné stěny a/nebo buněčné membrány, aby se uvolnily intracelulární tekutiny obsahující požadované nukleové kyseliny.
Odstranění nežádoucích nečistot. To zahrnuje membránové lipidy, proteiny a další nežádoucí nukleové kyseliny, které mohou interferovat s následnými aplikacemi.
Izolace. Existuje řada různých způsobů, jak izolovat požadované nukleové kyseliny z vámi vytvořeného vyčištěného lyzátu, které spadají do dvou hlavních kategorií: na bázi roztoku nebo v pevném stavu (viz další část).
Koncentrace. Poté, co byly nukleové kyseliny izolovány od všech ostatních kontaminantů a ředidel, jsou prezentovány ve vysoce koncentrovaném eluátu.
Dva typy extrakce
Existují dva typy extrakce nukleových kyselin – metody založené na roztoku a metody v pevné fázi. Metoda založená na roztoku je také známá jako metoda chemické extrakce, protože zahrnuje použití chemikálií k rozbití buňky a přístupu k jadernému materiálu. To může být použití buď organických sloučenin, jako je fenol a chloroform, nebo méně škodlivých, a proto více doporučovaných anorganických sloučenin, jako je proteináza K nebo silikagel.
Příklady různých metod chemické extrakce k rozbití buňky zahrnují:
- Osmotické protržení membrány
- Enzymatické trávení buněčné stěny
- Solubilizace membrány
- S detergenty
- S alkalickou úpravou
Techniky v pevné fázi, také známé jako mechanické metody, zahrnují využití toho, jak DNA interaguje s pevným substrátem. Výběrem perličky nebo molekuly, na kterou se bude DNA vázat, ale analyt nikoli, je možné tyto dva oddělit. Příklady technik extrakce v pevné fázi včetně použití oxidu křemičitého a magnetických kuliček.
Vysvětlení extrakce magnetických kuliček
Metoda extrakce magnetických kuliček
Potenciál pro extrakci pomocí magnetických kuliček byl poprvé rozpoznán v americkém patentu, který podal Trevor Hawkins pro výzkumnou instituci Whitehead Institute. Tento patent potvrdil, že bylo možné extrahovat genetický materiál jejich navázáním na pevný nosič, kterým by mohla být magnetická kulička. Princip spočívá v použití vysoce funkcionalizované magnetické kuličky, na kterou se naváže genetický materiál, který pak lze oddělit od supernatantu působením magnetické síly na vnější stranu nádobky se vzorkem.
Proč používat extrakci magnetických kuliček?
Technologie extrakce magnetických kuliček je stále více rozšířená díky potenciálu, který má pro rychlé a účinné extrakční postupy. V nedávné době došlo k vývoji vysoce funkcionalizovaných magnetických kuliček s vhodnými pufrovacími systémy, které umožnily automatizaci extrakce nukleových kyselin a pracovní postup, který je velmi nenáročný na zdroje a nákladově efektivní. Metody extrakce magnetickými kuličkami také nezahrnují kroky odstřeďování, které mohou způsobit smykové síly, které rozbijí delší kusy DNA. To znamená, že delší řetězce DNA zůstávají nedotčeny, což je důležité při testování genomiky.
Čas odeslání: 25. listopadu 2022