Zavedení
Co je extrakce nukleové kyseliny?
V nejjednodušších termínech je extrakce nukleových kyselin odstranění RNA a/nebo DNA ze vzorku a veškerý přebytek, který není nutný. Proces extrakce izoluje nukleové kyseliny ze vzorku a poskytuje je ve formě koncentrovaného eluátu, bez ředidel a kontaminantů, které by mohly ovlivnit jakékoli následné aplikace.
Aplikace extrakce nukleových kyselin
Purifikované nukleové kyseliny se používají v celé řadě různých aplikací, v rozmezí v několika různých průmyslových odvětvích. Zdravotní péče je možná oblast, kde se nejvíce používá, s purifikovanou RNA a DNA vyžadovanou pro řadu různých různých účelů testování.
Aplikace extrakce nukleových kyselin ve zdravotnictví zahrnují:
- Sekvenování nové generace (NGS)
- Genotypizace SNP založeného na zesílení
- Genotypizace založená na poli
- Digesce restrikčního enzymu
- Analýzy pomocí modifikačních enzymů (např. Ligace a klonování)
Existují také další pole mimo zdravotní péči, kde se používá extrakce nukleových kyselin, včetně, ale nejen na testování otcovství, forenzní a genomiku.
Krátká anamnéza extrakce nukleových kyselin
Extrakce DNADatuje dlouhou cestu, přičemž první známou izolaci provedl v roce 1869 švýcarský lékař jménem Friedrich Miescher. Miescher doufal, že vyřeší základní principy života stanovením chemického složení buněk. Poté, co selhal s lymfocyty, byl schopen získat surovou sraženinu DNA z leukocytů nalezených v hnisu na vyřazené obvazy. Udělal to přidáním kyseliny a alkalií do buňky, aby opustil cytoplazmu buňky, a poté vyvinul protokol pro oddělení DNA od ostatních proteinů.
Po průlomovém výzkumu Mieschera mnoho dalších vědců pokračovalo postupovat a vyvíjet techniky pro izolaci a čištění DNA. Edwin Joseph Cohn, proteinový vědec vyvinul mnoho technik pro čištění proteinů během druhé světové války. Byl zodpovědný za izolaci sérového albuminového frakce krevní plazmy, což je důležité při zachování osmotického tlaku v krevních cévách. To bylo zásadní pro udržení vojáků naživu.
V roce 1953 Francis Crick spolu s Rosalind Franklin a James Watson určil strukturu DNA, což ukazuje, že byla tvořena dvěma prameny dlouhých řetězců nukleotidů nukleových kyselin. Tento průlomový objev vydláždil cestu pro Meselson a Stahl, kteří byli schopni vyvinout protokol centrifugace gradientu pro izolaci DNA z bakterií E. coli, když prokázali polokonzervativní replikaci DNA během jejich experimentu z roku 1958.
Techniky extrakce nukleových kyselin
Jaké jsou 4 fáze extrakce DNA?
Všechny metody extrakce se scvrkávají na stejné základní kroky.
Narušení buněk. Tato fáze, také známá jako buněčná lýza, zahrnuje rozbití buněčné stěny a/nebo buněčné membrány, aby se uvolnily intralulární tekutiny obsahující zajímavé nukleové kyseliny.
Odstranění nežádoucích zbytků. To zahrnuje membránové lipidy, proteiny a další nežádoucí nukleové kyseliny, které mohou interferovat do následných aplikací.
Izolace. Existuje řada různých způsobů, jak izolovat zájmové kyseliny nukleových z vyčištěného lyzátu, který jste vytvořili, který spadá mezi dvě hlavní kategorie: založené na řešení nebo pevný stav (viz další část).
Koncentrace. Poté, co byly nukleové kyseliny izolovány ze všech ostatních kontaminantů a ředitelů, jsou prezentovány na vysoce koncentrovaném eluátu.
Dva typy extrakce
Existují dva typy extrakce nukleových kyselin - metody založené na roztoku a metody pevného stavu. Metoda založená na roztoku je také známá jako metoda chemické extrakce, protože zahrnuje použití chemikálií k rozbití buňky a přístup k nukleickému materiálu. To může být používat buď organické sloučeniny, jako je fenol a chloroform, nebo méně škodlivé, a proto doporučující anorganické sloučeniny, jako je proteináza K nebo silikagel.
Příklady různých metod chemické extrakce pro rozložení buňky zahrnují:
- Osmotické roztržení membrány
- Enzymatické trávení buněčné stěny
- Solubilizace membrány
- s detergenty
- s léčbou alkalií
Techniky pevného stavu, známé také jako mechanické metody, zahrnují využití toho, jak DNA interaguje s pevným substrátem. Výběrem korálky nebo molekuly, na které se DNA váže, ale analyt nebude, je možné je oddělit. Příklady technik extrakce v pevné fázi včetně použití oxidu křemičitého a magnetických kuliček.
Vysvětlena extrakce magnetických korálků
Metoda extrakce magnetických korálků
Potenciál pro extrakci pomocí magnetických korálků byl poprvé uznán v americkém patentu podaném Trevorem Hawkinsem pro výzkumnou instituci Whitehead Institute. Tento patent uznal, že je možné extrahovat genetický materiál tím, že je navázal na solidní nosič podpůrného, který by mohl být magnetický korálek. Princip je, že používáte vysoce funkcionalizovanou magnetickou kuličku, na kterou se genetický materiál váže, na který lze poté oddělit od supernatantu použitím magnetické síly na vnější stranu nádoby, která drží vzorek.
Proč používat extrakci magnetických korálků?
Technologie extrakce magnetických korálků se stále více stává převládajícím kvůli potenciálu, který má pro rychlé a efektivní postupy extrakce. V nedávné době došlo k vývoji vysoce funkcionalizovaných magnetických kuliček s vhodnými pufrovými systémy, které umožnily automatizaci extrakce nukleových kyselin a pracovního postupu, který je velmi lehký a nákladově efektivní. Rovněž metody extrakce magnetických kuliček nezahrnují kroky odstředění, které mohou způsobit smykové síly, které rozbíjejí delší kousky DNA. To znamená, že delší prameny DNA zůstávají neporušené, což je důležité při testování genomiky.
Čas příspěvku: listopadu-25-2022