Při pipetování objemů od 0,2 do 5 µl je nanejvýš důležitá přesnost a přesnost pipetování. Dobrá technika pipetování je nezbytná, protože chyby při manipulaci jsou zjevnější u malých objemů.
Vzhledem k tomu, že je kladen větší důraz na snižování reagencií a nákladů, jsou velmi žádané menší objemy, např. pro přípravu PCR Mastermix nebo enzymových reakcí. Pipetování malých objemů od 0,2 do 5 µl však představuje nové výzvy pro přesnost a přesnost pipetování. Důležité jsou následující body:
- Velikost pipety a špičky: Vždy vybírejte pipetu s co nejnižším jmenovitým objemem a nejmenší špičkou, aby byl vzduchový polštářek co nejmenší. Při pipetování např. 1 µL zvolte raději 0,25 – 2,5 µL pipetu a odpovídající špičku než 1 – 10 µL pipetu.
- Kalibrace a údržba: Je nezbytné, aby byly vaše pipety správně kalibrovány a udržovány. Malé úpravy a rozbité části na pipetě vedou k masivnímu nárůstu hodnot systematických a náhodných chyb. Kalibrace podle ISO 8655 musí být provedena jednou ročně.
- Pipety s pozitivním výtlakem: Zkontrolujte, zda ve vaší laboratoři nemáte pipetu s pozitivním výtlakem s nízkým rozsahem objemu. Obecně použití tohoto typu pipety vede k lepšímu výsledku pipetování z hlediska přesnosti a preciznosti než u klasických pipet se vzduchovým polštářkem.
- Zkuste použít větší objemy: Můžete zvážit naředění vzorku na pipetování větších objemů se stejným množstvím v konečné reakci. To může snížit chyby při pipetování u velmi malých objemů vzorků.
Kromě dobrého nástroje musí mít výzkumník velmi dobrou techniku pipetování. Věnujte zvláštní pozornost následujícím krokům:
- Upevnění špičky: Nepřiskřípněte pipetu ke špičce, mohlo by dojít k poškození jemného konce špičky a přesměrování paprsku kapaliny nebo poškození ústí. Při nasazování špičky vyvíjejte pouze mírný tlak a používejte pipetu s odpruženým kuželem špičky.
- Držení pipety: Nedržte pipetu v ruce, když čekáte na centrifugu, cyklovač atd. Vnitřek pipety se zahřeje a způsobí roztažení vzduchového polštáře, což má za následek odchylky od nastaveného objemu při pipetování.
- Předvlhčení: Zvlhčením vzduchu uvnitř špičky a pipety se špička připraví na vzorek a zabrání se odpařování při nasávání přenášeného objemu.
- Vertikální aspirace: Toto je velmi důležité při manipulaci s malými objemy, aby se zabránilo kapilárnímu efektu, ke kterému dochází, když je pipeta držena pod úhlem.
- Hloubka ponoření: Špičku ponořte co nejméně, abyste zabránili vniknutí kapaliny do špičky v důsledku kapilárního efektu. Základní pravidlo: Čím menší je špička a objem, tím menší je hloubka ponoření. Při pipetování malých objemů doporučujeme maximálně 2 mm.
- Dávkování pod úhlem 45°: Optimální výtok kapaliny je zaručen, když je pipeta držena pod úhlem 45°.
- Kontakt se stěnou nádoby nebo povrchem kapaliny: Malé objemy lze správně dávkovat pouze tehdy, když je hrot přidržován ke stěně nádoby nebo je ponořen do kapaliny. I poslední kapka ze špičky může být přesně dávkována.
- Vyfouknutí: Vyfouknutí je povinné po nadávkování malých objemů, aby se vystříkla i poslední kapka kapaliny přítomné ve špičce. Vyfukování by mělo být také provedeno proti stěně nádoby. Při provádění vyfukování na povrch kapaliny dávejte pozor, aby se do vzorku nedostaly vzduchové bubliny.
Čas odeslání: 18. února 2021