I když by teoreticky stačila jedna molekula templátu, pro klasickou PCR se typicky používá podstatně větší množství DNA, například až 1 ug genomové savčí DNA a jen 1 pg plazmidové DNA. Optimální množství závisí do značné míry na počtu kopií cílové sekvence a také na její složitosti.
Pokud se použije velmi málo templátu, bude zapotřebí odpovídající zvýšení počtu amplifikačních cyklů pro získání dostatečného množství produktu. Taq polymeráza, která se používá pro většinu PCR experimentů, nemá korekční funkci (3'-5' exonukleázová aktivita); chyby vyskytující se během amplifikace tedy nelze opravit. Čím vyšší je počet cyklů, tím převládající bude amplifikace vadného produktu. Pokud je naopak množství templátu příliš vysoké, zvýší se pravděpodobnost nasednutí primerů na jiné (nikoli stoprocentně komplementární) sekvence a také tvorba dimerů primerů, což povede k amplifikaci vedlejší produkty. V mnoha případech je DNA izolována z buněčných kultur nebo z mikroorganismů a následně použita jako templát pro PCR. Po purifikaci je nutné určit koncentraci DNA, aby bylo možné definovat objem potřebný pro nastavení PCR. Zatímco elektroforéza na agarózovém gelu může sloužit k odhadu, tato metoda není ani zdaleka přesná. UV-Vis spektrofotometrie byla zavedena jako zlatý standard pro kvantifikaci nukleových kyselin; tato přímá a tedy snadná a rychlá metoda měří absorbanci vzorku při 260 nm a koncentrace se vypočítává pomocí konverzního faktoru.
Pokud je však koncentrace DNA velmi nízká (< 1 µg/ml dsDNA), nebo pokud je kontaminována látkami, které také absorbují v rozsahu 260 nm (např. RNA, protein, soli), narazí tato metoda na svá omezení. V případě velmi nízkých koncentrací se naměřené hodnoty brzy stanou příliš nepřesnými na to, aby byly použitelné, a kontaminace povedou k (někdy enormnímu) nadhodnocení skutečné hodnoty. V tomto případě může být alternativou kvantifikace pomocí fluorescence. Tato technika je založena na použití fluorescenčního barviva, které se specificky váže na dsDNA, pouze komplex obsahující nukleovou kyselinu a barvivo je excitován světlem a následně bude emitovat světlo o mírně vyšší vlnové délce. Zde je intenzita fluorescenčního signálu úměrná množství DNA a pro stanovení koncentrace se vyhodnocuje ve vztahu ke standardní křivce. Výhody této metody spočívají ve specifičnosti vazby, která vylučuje vnější vlivy vnesené kontaminací, a také ve výsledné schopnosti detekovat velmi nízké koncentrace DNA. Vhodnost obou metod závisí především na koncentraci a čistotě vzorku; v mnoha případech může být dokonce vhodné použít obě metody paralelně.
Čas odeslání: 30. listopadu 2022