A standardizazione di i prucessi include a so ottimisazione è u stabilimentu sussegwente è l'armonizazione, chì permettenu un rendiment ottimale à longu andà - indipindente di l'utilizatori. A standardizazione assicura risultati di alta qualità, cum'è a so riproducibilità è cumparabilità.
U scopu di a PCR (classica) hè a generazione di un risultatu affidabile è riproducibile. Per certe applicazioni, u rendiment di uU pruduttu PCRhè ancu pertinente. Per queste reazzioni, deve esse cura per assicurà chì i campioni ùn sò micca cumprumessi è chì u flussu di travagliu PCR ferma stabile. In particulare, questu si traduce à minimizzà l'intruduzioni di contaminazioni chì puderanu purtà à risultati falsi pusitivi o falsi negativi o ancu inibisce a reazione PCR. Inoltre, e cundizioni di reazione devenu esse u più identiche pussibule per ogni mostra individuale in una corsa è ancu esse trasferibili à e reazzioni successive (di u stessu metudu). Questu si riferisce à a cumpusizioni di e reazzioni è ancu à u tipu di cuntrollu di temperatura in u cycler. L'errore di l'utilizatori, di sicuru, deve esse evitata quant'è pussibule.
Quì sottu, dimustraremu i sfidi chì sò scontri durante a preparazione è durante a corsa di una PCR - è l'approcciu di soluzioni chì esistenu in quantu à i strumenti è i consumabili utilizati per a standardizazione di i flussi di travagliu PCR.
Preparazione di a reazione
A dispensazione di cumpunenti di reazione in vasi di PCR, o piastre, rispettivamente, comprende parechje sfide chì deve esse superatu:
Cundizioni di reazione
A dosing esatta è precisa di i cumpunenti individuali hè indispensabile quandu mira à e cundizioni di reazione più identiche pussibuli. In più di una bona tecnica di pipetting, a selezzione di l'uttellu ghjustu hè critica. I master-mix PCR cuntenenu spessu sustanzi chì aumentanu a viscosità o generanu schiuma. Durante u prucessu di pipetting, questi portanu à una bagnatura sustanciale di upunte di pipette, riducendu cusì a precisione di pipetting. L'usu di sistemi di dispensazione diretta o punte di pipette alternative chì sò menu propensi à umidificà pò migliurà l'accuratezza è a precisione di u prucessu di pipetting.
Cuntaminazioni
Durante u prucessu di dispensazione, sò generati aerosols chì, se permettenu di ghjunghje à l'internu di a pipetta, ponu potenzialmente contaminà un altru campione durante u prossimu passu di pipetting. Questu pò esse impeditu usendu punte di filtru o sistemi di spustamentu direttu.
Consumables cum'ècunsiglii, i vasi è i piatti chì sò usati in u flussu di travagliu PCR ùn deve micca cuntene sustanzi chì cumprumettenu a mostra o falsificà u risultatu. Questi includenu DNA, DNases, RNases è inhibitori di PCR, è ancu cumpunenti chì ponu potenzialmente liscià da u materiale durante a reazione - sustanzi cunnisciuti cum'è leachables.
Errore d'utilizatore
Quantu più campioni sò trattati, più altu hè u risicu di errore. Pò accade facilmente chì una mostra hè pipettata in u vasu sbagliatu o in u pozzu sbagliatu. Stu risicu pò esse ridutta considerablemente da a marcatura facilmente discernibile di i pozzi. Per mezu di l'automatizazione di i passi di dispensazione, u "fattore umanu", vale à dì, l'errori è e variazioni di l'utilizatori, sò minimizati, cusì aumentendu a riproducibilità, soprattuttu in u casu di picculi volumi di reazione. Questu hè bisognu di platti di stabilità dimensionale sufficiente per esse impiegati in una stazione di travagliu. I codici a barre attaccati furniscenu una leggibilità di a macchina supplementaria, chì simplifica u seguimentu di campioni in tuttu u prucessu.
Prugrammazione di u termociclatore
A prugrammazione di un strumentu pò dimustrà ch'ellu hè assai tempu è propensu à l'errore. Diverse funzioni di u termociclatore PCR travaglianu inseme per simplificà stu passu di prucessu è, più impurtante, per rende sicuru:
U funziunamentu faciule è una bona guida di l'utilizatori sò a basa di una prugrammazione efficiente. Basendu nantu à sta fundazione, l'amministrazione di l'utilizatori protetti da password impedirà chì i so prugrammi sò alterati da altri utilizatori. Se parechji ciclichi (di u listessu tipu) sò in usu, hè benefiziu se un prugramma pò esse trasferitu direttamente da un strumentu à l'altru via USB o cunnessione. U software di computer permette l'amministrazione centrale è sicura di i prugrammi, i diritti di l'utilizatori è i ducumenti in un urdinatore.
Corsa PCR
Durante a corsa, l'ADN hè amplificatu in u vasu di reazione, induve ogni mostra deve esse sottumessu à cundizioni di reazione identiche è coerenti. I seguenti aspetti sò pertinenti per u prucessu:
Controlu di temperatura
Eccellente precisione in u cuntrollu di a temperatura è l'homogeneità di u bloccu di u ciclor sò a basa per un cundizionamentu uniforme di a temperatura di tutti i campioni. L'alta qualità di l'elementi di riscaldamentu è di rinfrescante (elementi peltier), è ancu a manera in quale sò cunnessi à u bloccu, sò i fatturi decisivi chì determinanu u risicu di discrepanzi di temperatura cunnisciutu com'è "effettu di bordu".
Evaporazione
A cuncentrazione di i cumpunenti di reazzione individuale ùn deve micca cambià in u cursu di a reazione per via di l'evaporazione. Altrimenti, hè pussibule chì assai pocuU pruduttu PCRpò esse generatu, o nimu. Hè dunque cruciale per minimizzà l'evaporazione assicurendu un sigillatu sicuru. In questu casu, a tappa riscaldata di u termociclatore è u sigillu di u bastimentu travaglianu in manu. Diverse opzioni di sigillatura sò dispunibiliPlaques PCR (ligame: Articulu di sigillatura), induve u megliu sigillamentu hè ottenutu da u termosaldatura. L'altri chjusi ponu ancu esse adattati, sempre chì a pressione di cuntattu di a tapa di u ciclor pò esse aghjustata à u segellu sceltu.
A standardizazione di u prucessu hè in piazza per salvaguardà risultati precisi è riproducibili à longu andà. Questu include u mantenimentu regulare di l'equipaggiu per assicurà chì hè sempre in boni cundizioni di travagliu. Tutti i consumabili duveranu esse di alta qualità constantemente in tutti i lotti pruduciuti, è a so dispunibilità affidabile deve esse garantita.
Tempu di Postu: Nov-29-2022