Ancu s'è in teoria, una molecula di u mudellu seria abbastanza, quantità considerablemente più grande di DNA sò tipicamente aduprate per una PCR classica, per esempiu, finu à 1 µg di DNA genomicu di mammiferi è appena 1 pg di DNA plasmidicu. A quantità ottima dipende largamente da u numeru di copie di a sequenza di destinazione, è ancu di a so cumplessità.
Se u mudellu assai pocu hè utilizatu, un aumentu currispundente in u numeru di ciculi di amplificazione serà necessariu per ottene una quantità sufficiente di pruduttu. Una polimerasi Taq chì hè aduprata per a maiò parte di l'esperimenti di PCR ùn hà micca una funzione di currezzione (attività exonuclease 3'-5'); cusì, l'errori accaduti durante l'amplificazione ùn ponu esse corretti. U più altu u numeru di ciculi, u più prevalenti serà l'amplificazione di u pruduttu difettu. Se, invece, a quantità di mudellu hè troppu altu, a probabilità di i primers annealing à altre sequenze (micca centu per centu cumplementarii), è ancu a furmazione di dimers di primer, aumenterà, chì hà da risultatu in l'amplificazione di sottoprodotti. In parechji casi, l'ADN hè isolatu da i culturi di cellule o da i microorganismi è dopu utilizatu com'è mudellu di PCR. Dopu a purificazione, hè necessariu di determinà a cuncentrazione di l'ADN per pudè definisce u voluminu chì hè necessariu per a configurazione di PCR. Mentre l'elettroforesi di gel d'agarose pò serve per furnisce una stima, stu metudu hè luntanu da esse precisu. A spettrofotometria UV-Vis hè stata stabilita cum'è u standard d'oru per a quantificazione di l'acidi nucleici; stu mètudu direttu è dunque faciule è rapidu misura l'assorbanza di a mostra à 260 nm, è a cuncentrazione hè calculata cù l'aiutu di un fattore di cunversione.
Se a cuncentrazione di DNA hè assai bassu, però (< 1 µg/mL dsDNA), o s'ellu hè contaminatu cù sustanzi chì assorbanu ancu in a gamma di 260 nm (per esempiu, RNA, proteina, sali), stu metudu ghjunghje à e so limitazioni. In u casu di cuncintrazioni assai bassu, e letture diventeranu prestu troppu imprecisu per esse d'utilizazione, è e contaminazioni portanu à (à volte enormi) sopravvalutazione di u valore attuale. In questu casu, a quantificazione cù fluorescenza pò presentà una alternativa. Sta tecnica hè basatu annantu à l'usu di un colorante fluoriscente chì si lega specificamente à dsDNA solu u cumplessu cumpostu di l'acidu nucleicu è u tintu hè eccitatu da a luce, è dopu emette luce di una lunghezza d'onda ligeramente più alta. Quì, l'intensità di u signale fluorescente hè proporzionale à a quantità di DNA, è per a determinazione di a cuncentrazione hè valutata in relazione à una curva standard. I vantaghji di stu metudu riposanu nantu à a specificità di u ligame, chì esclude l'influenzi esterni intruduti da a contaminazione, è ancu nantu à a capacità resultanti di detectà cuncintrazioni assai bassu di DNA. L'idoneità di ogni metudu dipende principarmenti da a cuncentrazione è a purità di mostra; in parechji casi pò ancu esse cunsigliatu di applicà i dui metudi in parallelu.
Tempu di post: 30-novembre-2022