Ang standardisasyon sa mga proseso naglakip sa ilang pag-optimize ug sunod-sunod nga pag-establisar ug pagkaharmonya, nga nagtugot sa dugay nga labing maayo nga pasundayag - independente sa tiggamit. Ang standardisasyon nagsiguro sa taas nga kalidad nga mga resulta, ingon man usab sa ilang reproducibility ug comparability.
Ang tumong sa (klasikong) PCR mao ang pagmugna og kasaligan ug reproducible nga resulta. Alang sa pipila ka mga aplikasyon, ang abot saprodukto sa PCRmay kalabutan usab. Alang sa kini nga mga reaksyon, kinahanglan nga mag-amping aron masiguro nga ang mga sample dili makompromiso ug nga ang workflow sa PCR magpabilin nga lig-on. Sa espesipiko, kini naghubad sa pagpamenos sa pagpaila sa mga kontaminasyon nga mahimong mosangpot sa sayop nga positibo o sayop nga negatibo nga mga resulta o bisan makapugong sa reaksyon sa PCR. Dugang pa, ang mga kondisyon sa reaksyon kinahanglan nga managsama kutob sa mahimo alang sa matag indibidwal nga sample sulod sa usa ka run ug mahimo usab nga mabalhin sa sunod nga mga reaksyon (sa parehas nga pamaagi). Kini nagtumong sa komposisyon sa mga reaksyon ingon man sa matang sa pagkontrolar sa temperatura sa cycler. Ang mga sayup sa tiggamit, siyempre, kinahanglan likayan kutob sa mahimo.
Sa ubos, among ipakita ang mga hagit nga masugatan panahon sa pagpangandam ug sa tibuok nga pagpadagan sa PCR – ug ang mga pamaagi sa mga solusyon nga anaa may kalabotan sa mga instrumento ug mga gamit nga gigamit para sa standardisasyon sa PCR workflows.
Pag-andam sa reaksyon
Ang pag-apod-apod sa mga sangkap sa reaksyon sa mga PCR-vessel, o mga plato, matag usa, naglangkob sa daghang mga hagit nga kinahanglan buntogon:
Mga kondisyon sa reaksyon
Ang eksakto ug tukma nga dosis sa mga indibidwal nga sangkap hinungdanon kung gipunting ang labing parehas nga mga kondisyon sa reaksyon nga posible. Dugang sa usa ka maayo nga pamaagi sa pipetting, ang pagpili sa husto nga himan hinungdanon. Ang mga master-mix sa PCR kanunay adunay mga substansiya nga makapadugang sa viscosity o makamugna og bula. Atol sa proseso sa pipetting, kini modala ngadto sa igo nga basa sa mgamga tip sa pipette, sa ingon makunhuran ang katukma sa pipetting. Ang paggamit sa direkta nga mga sistema sa pag-apod-apod o alternatibo nga mga tip sa pipette nga dili kaayo dali nga mabasa makapauswag sa katukma ug katukma sa proseso sa pipetting.
Mga kontaminasyon
Atol sa proseso sa dispensing, ang mga aerosol namugna nga, kon tugotan nga makaabot sa sulod sa pipette, posibleng makahugaw sa laing sample atol sa sunod nga pipetting nga lakang. Mahimo kining mapugngan pinaagi sa paggamit sa mga tip sa filter o direkta nga mga sistema sa pagbalhin.
Mga gamit sama samga tip, mga sudlanan ug mga plato nga gigamit sa PCR workflow kinahanglan dili maglangkob sa mga substansiya nga makakompromiso sa sample o mapeke ang resulta. Naglakip kini sa DNA, DNases, RNases ug PCR inhibitors, ingon man mga sangkap nga mahimo’g matunaw gikan sa materyal sa panahon sa reaksyon - mga substansiya nga nailhan nga mga leachable.
Kasaypanan sa tiggamit
Ang daghang mga sampol nga giproseso, mas taas ang peligro sa sayup. Kini dali nga mahitabo nga ang usa ka sample gipipet sa sayup nga sudlanan o sa sayup nga atabay. Kini nga risgo mamenosan pag-ayo pinaagi sa daling mailhan nga pagmarka sa mga atabay. Pinaagi sa pag-automate sa mga lakang sa pag-apod-apod, ang "human nga hinungdan", ie, mga sayup ug mga kalainan nga may kalabotan sa tiggamit, gipamubu, sa ingon nagdugang ang pag-reproducibility, labi na sa kaso sa gagmay nga mga volume sa reaksyon. Nagkinahanglan kini og mga plato nga adunay igo nga dimensional nga kalig-on aron magamit sa usa ka workstation. Ang mga gilakip nga barcode naghatag dugang nga pagkabasa sa makina, nga nagpasimple sa pagsubay sa sample sa tibuuk nga proseso.
Pagprograma sa thermocycler
Ang pagprograma sa usa ka instrumento mahimong mapamatud-an nga makagugol sa oras ingon man dali nga sayup. Ang lainlaing mga bahin sa PCR thermal cycler nagtinabangay aron mapasimple kini nga lakang sa proseso ug, labing hinungdanon, aron mahimo kini nga luwas:
Ang dali nga operasyon ug maayong giya sa tiggamit mao ang sukaranan sa episyente nga pagprograma. Pagtukod sa kini nga pundasyon, ang pagdumala sa tiggamit nga giprotektahan sa password magpugong sa kaugalingon nga mga programa nga usbon sa ubang mga tiggamit. Kung daghang mga siklista (sa parehas nga tipo) ang gigamit, kini mapuslanon kung ang usa ka programa mahimong direktang ibalhin gikan sa usa ka instrumento ngadto sa lain pinaagi sa USB o koneksyon. Ang software sa kompyuter makahimo sa sentral ug luwas nga pagdumala sa mga programa, katungod sa tiggamit ug mga dokumento sa usa ka kompyuter.
PCR run
Atol sa pagdagan, ang DNA gipadako sa sudlanan sa reaksyon, diin ang matag sample kinahanglan ipailalom sa parehas, makanunayon nga kondisyon sa reaksyon. Ang mosunud nga mga aspeto adunay kalabotan sa proseso:
Pagkontrol sa temperatura
Ang maayo kaayo nga katukma sa pagkontrol sa temperatura ug homogeneity sa cycler block mao ang basehan alang sa bisan temperatura nga pagkondisyon sa tanan nga mga sample. Ang taas nga kalidad sa mga elemento sa pagpainit ug pagpabugnaw (peltier nga mga elemento), ingon man ang paagi diin kini konektado sa block, mao ang mga hinungdan sa pagdesisyon nga magtino sa peligro sa mga kalainan sa temperatura nga nailhan nga "edge effect"
Pag-alisngaw
Ang mga konsentrasyon sa indibidwal nga mga sangkap sa reaksyon kinahanglan dili mausab sa dagan sa reaksyon tungod sa pag-alisngaw. Kung dili, posible nga gamay raprodukto sa PCRmahimong mamugna, o wala gayud. Busa hinungdanon nga mamenosan ang pag-alisngaw pinaagi sa pagsiguro sa usa ka luwas nga selyo. Sa kini nga kaso, ang gipainit nga taklob sa thermocycler ug ang selyo sa sudlanan nagtrabaho nga magkauban. Lain-laing mga opsyon sa pagbugkos anaa alang saMga palid sa PCR (link: Artikulo sa pagsilyo), diin ang pinakamaayo nga selyo makab-ot pinaagi sa heat sealing. Ang uban nga mga pagsira mahimo usab nga angay, basta ang presyur sa pagkontak sa taklob sa cycler mahimong ipasibo sa napili nga selyo.
Ang pag-standardize sa proseso gipahimutang aron mapanalipdan ang tukma ug mabag-o nga mga resulta sa taas nga termino. Apil na niini ang regular nga pagmentinar sa mga ekipo aron masiguro nga kini anaa kanunay sa maayong kahimtang sa pagtrabaho. Ang tanan nga mga magamit kinahanglan nga adunay kanunay nga taas nga kalidad sa tanan nga mga lote nga gihimo, ug ang ilang kasaligan nga magamit kinahanglan nga garantiya.
Panahon sa pag-post: Nob-29-2022