Criovialss'utilitzen habitualment per a l'emmagatzematge criogènic de línies cel·lulars i altres materials biològics crítics, en dewars plens de nitrogen líquid.

Hi ha diverses etapes implicades en la conservació exitosa de cèl·lules en nitrogen líquid. Tot i que el principi bàsic és una congelació lenta, la tècnica exacta emprada depèn del tipus de cèl·lula i del crioprotector utilitzat. Hi ha diverses consideracions de seguretat i bones pràctiques a tenir en compte quan s'emmagatzemen les cèl·lules a temperatures tan baixes.

Aquesta publicació pretén donar una visió general de com s'emmagatzemen els criovials en nitrogen líquid.

Què són els criovials

Els criovials són vials petits i amb tapa dissenyats per emmagatzemar mostres líquides a temperatures extremadament baixes. Asseguren que les cèl·lules conservades en el crioprotector no entrin en contacte directe amb el nitrogen líquid, minimitzant el risc de fractures cel·lulars tot i que es beneficien de l'efecte de refredament extrem del nitrogen líquid.

Els vials solen estar disponibles en una varietat de volums i dissenys: poden ser roscats internament o externament amb fons plans o arrodonits. També hi ha formats estèrils i no estèrils.

Qui utilitzaCyrovialsper emmagatzemar cèl·lules en nitrogen líquid

Diversos laboratoris privats i del NHS, així com institucions de recerca especialitzades en bancs de sang de cordó, biologia de cèl·lules epitelials, immunologia i biologia de cèl·lules mare utilitzen criovials per criopreservar cèl·lules.

Les cèl·lules conservades d'aquesta manera inclouen les cèl·lules B i T, les cèl·lules CHO, les cèl·lules mare hematopoètiques i progenitores, els hibridomes, les cèl·lules intestinals, els macròfags, les cèl·lules mare mesenquimàtiques i les progenitores, els monòcits, el mieloma, les cèl·lules NK i les cèl·lules mare pluripotents.

Visió general de com emmagatzemar criovials en nitrogen líquid

La criopreservació és un procés que conserva les cèl·lules i altres construccions biològiques refredant-les a temperatures molt baixes. Les cèl·lules es poden emmagatzemar en nitrogen líquid durant anys sense perdre la viabilitat cel·lular. Aquest és un esquema dels procediments emprats.

Preparació cel·lular

El mètode exacte per preparar les mostres variarà segons el tipus de cèl·lula, però en general, les cèl·lules es recullen i es centrifuguen per desenvolupar un pellet ric en cèl·lules. A continuació, aquest pellet es torna a suspendre en el sobrenedant barrejat amb un crioprotector o un medi de criopreservació.

Mitjà de criopreservació

Aquest medi s'utilitza per preservar les cèl·lules en els ambients de baixa temperatura als quals seran sotmeses inhibint la formació de cristalls intra i extracel·lulars i, per tant, la mort cel·lular. El seu paper és proporcionar un entorn segur i protector per a cèl·lules i teixits durant els processos de congelació, emmagatzematge i descongelació.

Un medi com ara plasma fresc congelat (FFP), solució de plasmalit heparinitzat o solucions lliures de sèrum i sense components animals es barreja amb crioprotectors com el dimetilsulfòxid (DMSO) o el glicerol.

El pellet de mostra re-liquificat es divideix en alícuotes en criovials de polipropilè com araVials d'emmagatzematge criogènic de l'empresa biomèdica de Suzhou Ace.

És important no omplir excessivament els criovials ja que això augmentarà el risc d'esquerdes i el possible alliberament de contingut (1).

Velocitat de congelació controlada

En general, s'utilitza una velocitat de congelació controlada lenta per a la criopreservació de les cèl·lules amb èxit.

Després de repartir les mostres en alíquotes en vials criogènics, es col·loquen sobre gel humit o en una nevera a 4 ℃ i el procediment de congelació s'inicia en 5 minuts. Com a guia general, les cèl·lules es refreden a una velocitat de -1 a -3 per minut (2). Això s'aconsegueix mitjançant un refrigerador programable o col·locant vials en una caixa aïllada col·locada en un congelador de velocitat controlada de -70 °C a -90 °C.

Transferir a nitrogen líquid

Els vials criogènics congelats es transfereixen a un dipòsit de nitrogen líquid durant períodes indefinits sempre que es mantingui una temperatura inferior a -135 ℃.

Aquestes temperatures ultra baixes es poden obtenir per immersió en el nitrogen en fase líquida o vapor.

Fase líquida o vapor?

Se sap que l'emmagatzematge en nitrogen en fase líquida manté la temperatura freda amb consistència absoluta, però sovint no es recomana per les raons següents:

• La necessitat de grans volums (profunditat) de nitrogen líquid que és un perill potencial. Les cremades o asfíxia per això són un risc real.
• Casos documentats de contaminació creuada per agents infecciosos com ara aspergillus, hep B i propagació viral a través del medi de nitrogen líquid (2,3)
• Possibilitat de filtració de nitrogen líquid als vials durant la immersió. Quan es treu de l'emmagatzematge i s'escalfa a temperatura ambient, el nitrogen s'expandeix ràpidament. En conseqüència, el vial es pot trencar quan s'elimina de l'emmagatzematge de nitrogen líquid, creant un perill tant per les deixalles volants com per l'exposició al contingut (1, 4).

Per aquests motius, l'emmagatzematge a temperatures ultra baixes és més freqüent en nitrogen en fase de vapor. Quan les mostres s'han d'emmagatzemar en fase líquida, s'han d'utilitzar tubs cryoflex especialitzats.

L'inconvenient de la fase de vapor és que es pot produir un gradient de temperatura vertical que provoca fluctuacions de temperatura entre -135 ℃ i -190 ℃. Això requereix un seguiment acurat i diligent dels nivells de nitrogen líquid i les variacions de temperatura (5).

Molts fabricants recomanen que els criovials siguin adequats per a l'emmagatzematge fins a -135 ℃ o només per utilitzar-los en fase de vapor.

Descongelar les teves cèl·lules criopreservades

El procediment de descongelació és estressant per a un cultiu congelat, i es requereix un maneig i una tècnica adequats per garantir la viabilitat, la recuperació i la funcionalitat òptimes de les cèl·lules. Els protocols de descongelació exactes dependran dels tipus de cèl·lules específics. Tanmateix, la descongelació ràpida es considera estàndard per:

• Disminueix qualsevol impacte en la recuperació cel·lular
• Ajuda a reduir el temps d'exposició als soluts presents en el medi de congelació
• Minimitzar qualsevol dany per recristal·lització de gel

Els banys d'aigua, els banys de perles o els instruments automatitzats especialitzats s'utilitzen habitualment per descongelar mostres.

Amb més freqüència, 1 línia cel·lular es descongela a la vegada durant 1-2 minuts, girant suaument en un bany d'aigua a 37 ℃ fins que només quedi una mica de gel a l'ampolla abans de rentar-les en un medi de creixement preescalfat.

Per a algunes cèl·lules com els embrions de mamífers, l'escalfament lent és essencial per a la seva supervivència.

Les cèl·lules ja estan preparades per al cultiu cel·lular, l'aïllament cel·lular o, en el cas de les cèl·lules mare hematopoètiques, estudis de viabilitat per garantir la integritat de les cèl·lules mare del donant abans de la teràpia mieloablativa.

És una pràctica normal prendre petites alíquotes de la mostra prerentada utilitzada per realitzar un recompte de cèl·lules per determinar les concentracions cel·lulars per a la placa en cultiu. A continuació, podeu avaluar els resultats dels procediments d'aïllament cel·lular i determinar la viabilitat cel·lular.

Bones pràctiques per a l'emmagatzematge de criovials

L'èxit de la criopreservació de les mostres emmagatzemades en criovials depèn de molts elements del protocol, inclòs l'emmagatzematge adequat i el manteniment de registres.

• Dividiu les cel·les entre ubicacions d'emmagatzematge– Si els volums ho permeten, dividiu les cèl·lules entre vials i emmagatzemeu-les en llocs separats per reduir el risc de pèrdua de mostres per fallades de l'equip.
• Evitar la contaminació creuada– Optar per vials criogènics estèrils d'un sol ús o autoclau abans del seu ús posterior
• Utilitzeu vials de mida adequada per a les vostres cèl·lules– Els vials es presenten en un rang de volums entre 1 i 5 ml. Eviteu omplir excessivament els vials per reduir el risc d'esquerdes.
• Seleccioneu vials criogènics amb rosca interna o externa– Algunes universitats recomanen els vials roscats internament com a mesures de seguretat; també poden prevenir la contaminació durant l'ompliment o quan s'emmagatzemen al nitrogen líquid.
• Evitar fuites- Utilitzeu segells bi-injectats modelats a la tapa de rosca o les anelles O per evitar fuites i contaminació.
• Utilitzeu codis de barres 2D i vials d'etiquetes– per garantir la traçabilitat, els vials amb grans àrees d'escriptura permeten etiquetar adequadament cada vial. Els codis de barres 2D poden ajudar amb la gestió de l'emmagatzematge i el manteniment de registres. Les tapes codificades per colors són útils per facilitar la identificació.
• Manteniment adequat d'emmagatzematge- Per garantir que les cèl·lules no es perdin, els recipients d'emmagatzematge han de controlar constantment la temperatura i els nivells de nitrogen líquid. S'han d'instal·lar alarmes per avisar els usuaris dels errors.

Precaucions de seguretat

El nitrogen líquid s'ha convertit en una pràctica habitual en la investigació moderna, però comporta el risc de lesions greus si s'utilitza incorrectament.

S'ha d'utilitzar un equip de protecció personal (EPI) adequat per minimitzar el risc de congelació, cremades i altres incidents adversos quan es manipula nitrogen líquid. Desgast

• Guants criogènics
• Bata de laboratori
• Pantalla facial completa resistent als impactes que també cobreix el coll
• Sabates de punta tancada
• Davantal de plàstic a prova d'esquitxades

Els refrigeradors de nitrogen líquid s'han de col·locar en zones ben ventilades per minimitzar el risc d'asfíxia: el nitrogen escapat es vaporitza i desplaça l'oxigen atmosfèric. Les botigues de gran volum haurien de tenir sistemes d'alarma de baix oxigen.

El treball en parella quan es manipula nitrogen líquid és ideal i s'ha de prohibir el seu ús fora de l'horari normal de treball.

Criovials per donar suport al vostre flux de treball

La companyia Suzhou Ace Biomedical ofereix una àmplia selecció de productes que satisfan les vostres necessitats de criopreservació per a diferents tipus de cèl·lules. La cartera inclou una gamma de tubs així com una gamma de criovials estèrils.

Els nostres criovials són:

• Tapa de rosca de laboratori 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Vials criogènics criovials Criotub de fons cònic amb junta

  ● Especificació de 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, amb faldilla o sense faldilla
  ● El disseny cònic o autònom, estèril o no estèril està disponible
  ● Els tubs de tap de rosca estan fets de polipropilè de grau mèdic
  ● Els vials de criotub de PP es poden congelar i descongelar repetidament
  ● El disseny de la tapa externa pot reduir la probabilitat de contaminació durant el tractament de la mostra.
  ● Tubs criogènics amb tap de rosca Rosca universal d'ús
  ● Els tubs s'adapten als rotors més comuns
  ● Els tubs d'anell tòric de tubs criogènics s'ajusten a caixes de congelació estàndard d'1 polzada i 2 polzades, 48 ​​pous, 81 pous, 96 pous i 100 pous.
  ● Autoclavable a 121°C i congelable a -86°C

  PART NÚM	MATERIAL	VOLUM	CAPCOLOR	PCS/BOSSA	BOSSES/CAIXA
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Negre, groc, blau, vermell, morat, blanc	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Negre, groc, blau, vermell, morat, blanc	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Negre, groc, blau, vermell, morat, blanc	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Negre, groc, blau, vermell, morat, blanc	500	10