CryovialsS’utilitzen habitualment per a l’emmagatzematge criogènic de línies cel·lulars i altres materials biològics crítics, en Dewars farcits de nitrogen líquid.

Hi ha diverses etapes implicades en la conservació amb èxit de cèl·lules en nitrogen líquid. Si bé el principi bàsic és una congelació lenta, la tècnica exacta utilitzada depèn del tipus de cèl·lula i del crioprotectant que s’utilitza. Hi ha diverses consideracions de seguretat i bones pràctiques a tenir en compte a l’hora d’emmagatzemar cèl·lules a temperatures tan baixes.

Aquesta publicació té com a objectiu donar una visió general de com es guarden els criovials en nitrogen líquid.

Què són els criovials

Els crisovials són vials petits i tapats dissenyats per emmagatzemar mostres de líquids a temperatures extremadament baixes. Es garanteixen que les cèl·lules conservades en crioprotectant no entrin en contacte directe amb el nitrogen líquid, minimitzant el risc de fractures cel·lulars alhora que es beneficia de l’efecte de refrigeració extrem del nitrogen líquid.

Els vials solen estar disponibles en diversos volums i dissenys: poden ser roscades internament o externament amb fons plans o arrodonits. També hi ha formats estèrils i no estèrils.

Qui fa servirCirovialsper emmagatzemar cèl·lules en nitrogen líquid

Una gamma de NHS i laboratoris privats, així com institucions de recerca especialitzades en la banca de sang del cordó, la biologia de les cèl·lules epitelials, la immunologia i la biologia de les cèl·lules mare, utilitzen criovials per criopreservar les cèl·lules.

Les cèl·lules conservades d’aquesta manera inclouen cèl·lules B i T, cèl·lules CHO, cèl·lules mare i progenitors hematopoietiques, hibridomes, cèl·lules intestinals, macròfags, tija mesenquimal i cèl·lules progenitores, monòcits, mieloma, cèl·lules NK i cèl·lules mare pluripotents.

Visió general de com emmagatzemar criovials en nitrogen líquid

La criopreservació és un procés que conserva les cèl·lules i altres construccions biològiques refredant -les a temperatures molt baixes. Les cèl·lules es poden emmagatzemar en nitrogen líquid durant anys sense pèrdua de viabilitat cel·lular. Es tracta d’un esquema dels procediments emprats.

Preparació de les cèl·lules

El mètode exacte per preparar mostres variarà en funció del tipus de cèl·lula, però en general, les cèl·lules es recullen i es centrifuen per desenvolupar un pellet ric en cèl·lules. Aquest pellet es torna a suspendre en el sobrenedant barrejat amb crioprotectant o un medi de criopreservació.

Medi de criopreservació

Aquest medi s’utilitza per preservar les cèl·lules en els ambients de baixa temperatura als quals serà objecte d’inhibir la formació de cristalls intra i extracel·lulars i, per tant, la mort cel·lular. El seu paper és proporcionar un entorn segur i protector per a les cèl·lules i els teixits durant els processos de congelació, emmagatzematge i descongelació.

Un medi com el plasma congelat fresc (FFP), la solució de plasmalia heparinitzada o les solucions lliures de components animals, sense sèrum, es barregen amb crioprotectants com el dimetil sulfoxid (DMSO) o el glicerol.

El pellet de mostra re-licificat es combina en criovials de polipropilè com araCompanyia biomèdica de Suzhou Ace Vial criogènic.

És important no desplaçar els criovials, ja que augmentarà el risc d’esquerdament i el possible alliberament de continguts (1).

Taxa de congelació controlada

En general, es fa servir una taxa de congelació controlada lenta per a la criopreservació amb èxit de les cèl·lules.

Després que les mostres s’alimentin en vials criogènics, es col·loquen sobre gel humit o en una nevera de 4 ℃ i el procediment de congelació s’inicia en 5 minuts. Com a guia general, les cèl·lules es refreden a un ritme de -1 a -3 per minut (2). Això s’aconsegueix mitjançant un refrigerador programable o col·locant vials en una caixa aïllada col·locada en un congelador de velocitat controlada de –70 ° C a –90 ° C.

Transferiu -lo al nitrogen líquid

Els vials criogènics congelats es transfereixen a un dipòsit de nitrogen líquid durant períodes indefinits, sempre que es mantingui una temperatura inferior a -135 ℃.

Aquestes temperatures ultra-baixes es poden obtenir per immersió en el nitrogen en fase líquid o de vapor.

Fase de líquid o vapor?

L’emmagatzematge en fase líquida nitrogen és conegut per mantenir la temperatura freda amb consistència absoluta, però sovint no es recomana per les següents raons:

• La necessitat de grans volums (profunditat) de nitrogen líquid que suposa un perill potencial. Les cremades o l’asfixia a causa d’això són un risc real.
• Casos documentats de contaminació creuada per agents infecciosos com Aspergillus, Hep B i la propagació viral a través del medi de nitrogen líquid (2,3)
• El potencial que el nitrogen líquid es filtri als vials durant la immersió. Quan s’elimina de l’emmagatzematge i s’escalfa a la temperatura ambient, el nitrogen s’expandeix ràpidament. En conseqüència, el vial pot destruir -se quan es treu de l’emmagatzematge de nitrogen líquid, creant un perill tant de restes voladores com de l’exposició al contingut (1, 4).

Per aquestes raons, l’emmagatzematge de temperatura ultra-baixa és més freqüent en nitrogen en fase de vapor. Quan s’han d’emmagatzemar mostres en fase líquida, s’ha d’utilitzar tubs especialitzats en crioflex.

L’avantatge de la fase de vapor és que es pot produir un gradient de temperatura vertical i es produeix fluctuacions de temperatura entre -135 ℃ i -190 ℃. Això requereix un seguiment minuciós i diligent dels nivells de nitrogen líquid i variacions de temperatura (5).

Molts fabricants recomanen que els criovials siguin adequats per emmagatzemar fins a -135 ℃ o per utilitzar -los només en fase de vapor.

Descongelant les cèl·lules criopreservades

El procediment de descongelació és estressant per a un cultiu congelat i es requereix una manipulació i una tècnica adequades per assegurar la viabilitat, la recuperació i la funcionalitat òptimes de les cèl·lules. Els protocols de descongelació exactes dependran dels tipus de cèl·lules específiques. Tot i això, es considera estàndard per a:

• Disminuir qualsevol impacte en la recuperació cel·lular
• Ajudeu a reduir el temps d’exposició als soluts presents als mitjans de congelació
• Minimitzar qualsevol dany per recristalització de gel

Els banys d’aigua, els banys de perles o els instruments automatitzats especialitzats s’utilitzen habitualment per descongelar les mostres.

El més freqüentment 1 línia cel·lular es descongela alhora durant 1-2 minuts, girant suaument en un bany d’aigua de 37 ℃ fins que quedi només una mica de gel que queda al vial abans que es rentin en un medi de creixement previed.

Per a algunes cèl·lules com els embrions de mamífers, l’escalfament lent és essencial per a la seva supervivència.

Les cèl·lules estan ara preparades per al cultiu cel·lular, l’aïllament de les cèl·lules o en el cas de cèl·lules mare hematopoietiques: estudis de viabilitat per garantir la integritat de les cèl·lules mare del donant abans de la teràpia mieloabladora.

És una pràctica normal agafar petites alícuotes de la mostra pre -preguada que s’utilitzen per realitzar un recompte de cèl·lules per determinar les concentracions cel·lulars per a la placa en el cultiu. A continuació, podeu avaluar els resultats dels procediments d’aïllament cel·lular i determinar la viabilitat cel·lular.

Bones pràctiques per a l’emmagatzematge de criovials

L’èxit de la criopreservació de mostres emmagatzemades en criovials depèn de molts elements del protocol, incloent l’emmagatzematge adequat i la conservació de registres.

• Divideix les cèl·lules entre les ubicacions d'emmagatzematge- Si els volums ho permeten, dividiu les cèl·lules entre vials i emmagatzemeu -les en llocs separats per reduir el risc de pèrdua de mostra a causa dels fracassos dels equips.
• Eviteu la contaminació creuada-Opteu per vials criogènics estèrils d’un sol ús o autoclau abans de l’ús posterior
• Utilitzeu vials de mida adequada per a les vostres cèl·lules- Els vials tenen una gamma de volums entre 1 i 5 mls. Eviteu els vials que s’aborden per reduir el risc d’esquerdament.
• Seleccioneu Vial criogènics interns o externs- Algunes universitats recomanen vials roscades internes per a mesures de seguretat: també poden evitar la contaminació durant el farcit o quan s’emmagatzemen al nitrogen líquid.
• Eviteu fuites-Utilitzeu segells injectats per bi-injectats a la tapa de cargol o a les anelles O per evitar fuites i contaminacions.
• Utilitzeu codis de barres 2D i vials d'etiqueta- Per assegurar la traçabilitat, els vials amb grans àrees d’escriptura permeten que cada vial s’etiqueti adequadament. Els codis de barres 2D poden ajudar a la gestió de l’emmagatzematge i al manteniment de registres. Els taps codificats per colors són útils per a una identificació més fàcil.
• Manteniment adequat d’emmagatzematge- Per assegurar -se que les cèl·lules no es perden, els vasos d’emmagatzematge han de controlar constantment la temperatura i els nivells de nitrogen líquid. Les alarmes s’han de muntar per alertar els usuaris d’errors.

Precaucions de seguretat

El nitrogen líquid s’ha convertit en una pràctica habitual en la investigació moderna, però té el risc de lesions greus si s’utilitza de manera incorrecta.

S’han de portar equips de protecció personal adequats (PPE) per minimitzar el risc de gelades, cremades i altres incidents adversos quan manipuleu nitrogen líquid. Utilitzar

• Guants criogènics
• Abric de laboratori
• Escut de cara completa resistent a l'impacte que també cobreix el coll
• Sabates de peus tancades
• Davantal de plàstic a prova de splash

Els refrigeradors de nitrogen líquid s’han de col·locar en zones ben ventilades per minimitzar el risc d’asfixia: el nitrogen escapçat vaporitza i desplaça l’oxigen atmosfèric. Els magatzems de gran volum han de tenir sistemes d’alarma d’oxigen baixos.

Treballar per parelles quan la manipulació de nitrogen líquid és ideal i s’ha de prohibir el seu ús fora de l’horari laboral normal.

Cryovials per donar suport al vostre flux de treball

Suzhou Ace Biomedical Company ofereix una àmplia selecció de productes que satisfan les vostres necessitats de criopreservació per a diferents tipus de cèl·lules. La cartera inclou una gamma de tubsas, així com una gamma de criòvials estèrils.

Els nostres criovials són:

• Cargol de cargol de laboratori 0,5 ml 1,5 ml de 2,0 ml de cordons criògens criògens cònics Cryotube amb junta

  ● Especificació de 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, amb faldilla o sense faldilla
  ● Disseny cònic o propi, estèril o no estèril
  ● Els tubs de tapa de cargol són de polipropilè de grau mèdic
  ● Els vials de criotub PP es poden congelar i descongelar repetidament
  ● El disseny de taps externs pot reduir la probabilitat de contaminació durant el tractament de la mostra.
  ● cargol Tubs criogènics Fils de cargol universals per utilitzar -los
  ● Els tubs s’ajusten a la majoria dels rotors comuns
  ● Tubs criogènics Els tubs O RING Fit Standard 1 polzada i 2 polzades, 48well, 81Well ， 96WELL i 100WELL Caixes congeladores
  ● Autoclavable a 121 ° C i es pot congelar a -86 ° C

  Part no	Material	Volum	TapaColor	PC/Bossa	Bosses/Funda
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Negre, groc, blau, vermell, morat, blanc	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5ml	Negre, groc, blau, vermell, morat, blanc	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5ml	Negre, groc, blau, vermell, morat, blanc	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ml	Negre, groc, blau, vermell, morat, blanc	500	10