L'estandardització dels processos inclou la seva optimització i el posterior establiment i harmonització, permetent un rendiment òptim a llarg termini, independentment de l'usuari. L'estandardització garanteix resultats d'alta qualitat, així com la seva reproductibilitat i comparabilitat.
L'objectiu de la PCR (clàssica) és la generació d'un resultat fiable i reproduïble. Per a determinades aplicacions, el rendiment de laProducte de PCRtambé és rellevant. Per a aquestes reaccions, s'ha de tenir cura de garantir que les mostres no es vegin compromeses i que el flux de treball de PCR es mantingui estable. Concretament, això es tradueix en minimitzar la introducció de contaminacions que podrien donar lloc a resultats falsos positius o falsos negatius o fins i tot inhibir la reacció de PCR. A més, les condicions de reacció han de ser tan idèntiques com sigui possible per a cada mostra individual dins d'una prova i també ser transferibles a les reaccions posteriors (del mateix mètode). Això fa referència a la composició de les reaccions així com al tipus de control de temperatura al ciclador. Els errors dels usuaris, per descomptat, s'han d'evitar tant com sigui possible.
A continuació, demostrarem els reptes que es troben durant la preparació i durant l'execució d'una PCR, i els enfocaments de les solucions que existeixen pel que fa als instruments i consumibles utilitzats per a l'estandardització dels fluxos de treball de la PCR.
Preparació de la reacció
La dispensació de components de reacció en recipients de PCR o plaques, respectivament, inclou múltiples reptes que s'han de superar:
Condicions de reacció
La dosificació exacta i precisa dels components individuals és indispensable per aconseguir les condicions de reacció més idèntiques possibles. A més d'una bona tècnica de pipeteig, és fonamental seleccionar l'eina adequada. Les mescles mestres de PCR sovint contenen substàncies que augmenten la viscositat o generen escuma. Durant el procés de pipeta, aquests condueixen a una humectació substancial de lapuntes de pipeta, reduint així la precisió del pipet. L'ús de sistemes de dispensació directa o puntes de pipeta alternatives que són menys propenses a la humectació pot millorar l'exactitud i la precisió del procés de pipeta.
Contaminacions
Durant el procés de dispensació, es generen aerosols que, si es deixen arribar a l'interior de la pipeta, poden contaminar una altra mostra durant el següent pas de pipeta. Això es pot evitar utilitzant puntes de filtre o sistemes de desplaçament directe.
Consumibles com araconsells, els recipients i plaques que s'utilitzen en el flux de treball de PCR no han de contenir substàncies que comprometin la mostra o falsifiquen el resultat. Aquests inclouen DNA, DNases, RNases i inhibidors de la PCR, així com components que poden filtrar-se del material durant la reacció: substàncies conegudes com a lixiviables.
Error d'usuari
Com més mostres es processin, més gran és el risc d'error. Pot passar fàcilment que una mostra sigui pipetada al recipient incorrecte o al pou incorrecte. Aquest risc es pot reduir considerablement mitjançant un marcatge fàcilment discernible dels pous. Mitjançant l'automatització dels passos de dispensació, es minimitzen el “factor humà”, és a dir, els errors i les variacions relacionades amb l'usuari, augmentant així la reproductibilitat, sobretot en el cas de volums de reacció petits. Això requereix plaques amb una estabilitat dimensional suficient per ser emprades en una estació de treball. Els codis de barres adjunts proporcionen una llegibilitat addicional per màquina, que simplifica el seguiment de les mostres durant tot el procés.
Programació del termociclador
La programació d'un instrument pot resultar molt llarga i propensa a errors. Les diferents funcions del termociclador de PCR funcionen juntes per simplificar aquest pas del procés i, el més important, per fer-lo segur:
Un funcionament fàcil i una bona guia de l'usuari són la base d'una programació eficient. A partir d'aquesta base, l'administració d'usuaris protegida amb contrasenya evitarà que els programes propis siguin alterats per altres usuaris. Si s'utilitzen diversos cicladors (del mateix tipus), és beneficiós que un programa es pugui transferir directament d'un instrument a un altre mitjançant USB o connectivitat. El programari informàtic permet l'administració central i segura de programes, drets d'usuari i documents en un ordinador.
Execució de PCR
Durant l'execució, l'ADN s'amplifica al recipient de reacció, on cada mostra s'ha de sotmetre a condicions de reacció idèntiques i coherents. Els aspectes següents són rellevants per al procés:
Control de temperatura
L'excel·lent precisió en el control de la temperatura i l'homogeneïtat del bloc ciclador són la base per a un condicionament uniforme de la temperatura de totes les mostres. L'alta qualitat dels elements d'escalfament i refrigeració (elements peltier), així com la forma en què aquests estan connectats al bloc, són els factors decisius que determinaran el risc de discrepàncies de temperatura conegut com a "efecte de vora".
Evaporació
Les concentracions dels components individuals de la reacció no haurien de canviar al llarg de la reacció a causa de l'evaporació. En cas contrari, és possible que molt pocProducte de PCRes pot generar, o cap. Per tant, és crucial minimitzar l'evaporació assegurant un segellat segur. En aquest cas, la tapa escalfada del termociclador i el segell del recipient funcionen de la mà. Hi ha diferents opcions de segellat disponiblesPlaques de PCR (enllaç: article de segellat), per la qual cosa s'aconsegueix el millor segellat mitjançant segellat tèrmic. També poden ser adequats altres tancaments, sempre que la pressió de contacte de la tapa del ciclador es pugui ajustar al segell seleccionat.
L'estandardització de processos està en marxa per tal de salvaguardar resultats precisos i reproduïbles a llarg termini. Això inclou el manteniment periòdic de l'equip per garantir que sempre estigui en bones condicions de funcionament. Tots els consumibles han de ser d'alta qualitat constant en tots els lots produïts i s'ha de garantir la seva disponibilitat fiable.
Hora de publicació: 29-nov-2022