Introducció
Què és l'extracció d'àcids nucleics?
En els termes més senzills, l'extracció d'àcids nucleics és l'eliminació de l'ARN i/o DNA d'una mostra i tot l'excés que no sigui necessari. El procés d'extracció aïlla els àcids nucleics d'una mostra i els produeix en forma d'eluat concentrat, lliure de diluents i contaminants que puguin afectar qualsevol aplicació posterior.
Aplicacions de l'extracció d'àcids nucleics
Els àcids nucleics purificats s'utilitzen en una gran quantitat d'aplicacions diferents, que abasten múltiples indústries diferents. L'assistència sanitària és potser l'àrea on s'utilitza més, amb ARN i ADN purificats necessaris per a una sèrie de propòsits de proves diferents.
Les aplicacions de l'extracció d'àcids nucleics a la salut inclouen:
- Seqüenciació de nova generació (NGS)
- Genotipat SNP basat en amplificació
- Genotipat basat en matrius
- Digestió amb enzims de restricció
- Anàlisis utilitzant enzims modificadors (per exemple, lligació i clonació)
També hi ha altres camps més enllà de la sanitat on s'utilitza l'extracció d'àcids nucleics, com ara proves de paternitat, forense i genòmica.
Una breu història de l'extracció d'àcids nucleics
Extracció d'ADNdata de molt lluny, amb el primer aïllament conegut que va ser realitzat per un metge suís anomenat Friedrich Miescher el 1869. Miescher esperava resoldre els principis fonamentals de la vida determinant la composició química de les cèl·lules. Després de fallar amb els limfòcits, va poder obtenir un precipitat brut d'ADN dels leucòcits trobats en pus en embenats rebutjats. Ho va fer afegint àcid i després àlcali a la cèl·lula per deixar el citoplasma de la cèl·lula, i després va desenvolupar un protocol per separar l'ADN de les altres proteïnes.
Després de la investigació innovadora de Miescher, molts altres científics han avançat i han desenvolupat tècniques per aïllar i purificar l'ADN. Edwin Joseph Cohn, un científic de proteïnes va desenvolupar moltes tècniques per a la purificació de proteïnes durant la Segona Guerra Mundial. Va ser el responsable d'aïllar la fracció d'albúmina sèrica del plasma sanguini, que és important per mantenir la pressió osmòtica als vasos sanguinis. Això va ser crucial per mantenir els soldats amb vida.
L'any 1953 Francis Crick, juntament amb Rosalind Franklin i James Watson, van determinar l'estructura de l'ADN, demostrant que estava format per dues cadenes llargues de nucleòtids d'àcid nucleic. Aquest descobriment innovador va obrir el camí per a Meselson i Stahl, que van poder desenvolupar un protocol de centrifugació de gradient de densitat per aïllar l'ADN dels bacteris E. Coli mentre van demostrar la replicació semiconservadora de l'ADN durant el seu experiment de 1958.
Tècniques d'extracció d'àcids nucleics
Quines són les 4 etapes de l'extracció de l'ADN?
Tots els mètodes d'extracció es redueixen als mateixos passos fonamentals.
Disrupció cel·lular. Aquesta etapa, també coneguda com a lisi cel·lular, consisteix a trencar la paret cel·lular i/o la membrana cel·lular, per tal d'alliberar els fluids intracel·lulars que contenen els àcids nucleics d'interès.
Eliminació de residus no desitjats. Això inclou lípids de membrana, proteïnes i altres àcids nucleics no desitjats que poden interferir amb les aplicacions aigües avall.
Aïllament. Hi ha diverses maneres diferents d'aïllar els àcids nucleics d'interès del lisat aclarit que heu creat, que es divideixen en dues categories principals: en solució o en estat sòlid (vegeu la secció següent).
Concentració. Després que els àcids nucleics s'han aïllat de tots els altres contaminants i diluents, es presenten en un eluat altament concentrat.
Els dos tipus d'extracció
Hi ha dos tipus d'extracció d'àcids nucleics: mètodes basats en solució i mètodes d'estat sòlid. El mètode basat en solució també es coneix com a mètode d'extracció química, ja que consisteix a utilitzar productes químics per trencar la cèl·lula i accedir al material nucleic. Això pot ser utilitzant compostos orgànics com el fenol i el cloroform, o els compostos inorgànics menys nocius i, per tant, més recomanats com la Proteinasa K o el gel de sílice.
Alguns exemples de diferents mètodes d'extracció química per trencar una cèl·lula inclouen:
- Trencament osmòtic de membrana
- Digestió enzimàtica de la paret cel·lular
- Solubilització de la membrana
- Amb detergents
- Amb tractament àlcali
Les tècniques d'estat sòlid, també conegudes com a mètodes mecànics, impliquen explotar com l'ADN interacciona amb un substrat sòlid. En seleccionar una perla o molècula a la qual s'unirà l'ADN però l'analit no, és possible separar els dos. Exemples de tècniques d'extracció en fase sòlida que inclouen l'ús de sílice i perles magnètiques.
Explicació de l'extracció de comptes magnètics
El mètode d'extracció de perles magnètiques
El potencial d'extracció mitjançant perles magnètiques es va reconèixer per primera vegada en una patent dels EUA presentada per Trevor Hawkins, per a la institució de recerca de l'Institut Whitehead. Aquesta patent reconeixia que era possible extreure material genètic unint-lo a un suport sòlid, que podria ser una perla magnètica. El principi és que utilitzeu una perla magnètica altament funcionalitzada a la qual s'unirà el material genètic, que després es pot separar del sobrenedant aplicant una força magnètica a l'exterior del recipient que conté la mostra.
Per què utilitzar l'extracció de comptes magnètics?
La tecnologia d'extracció de perles magnètiques és cada cop més freqüent, a causa del potencial que té per a procediments d'extracció ràpids i eficients. En els últims temps s'han desenvolupat perles magnètiques altament funcionalitzades amb sistemes tampó adequats, que han fet possible l'automatització de l'extracció d'àcids nucleics i un flux de treball molt lleuger en recursos i rendible. A més, els mètodes d'extracció de perles magnètiques no impliquen els passos de centrifugació que poden provocar forces de cisalla que trenquin peces més llargues d'ADN. Això significa que les cadenes més llargues d'ADN romanen intactes, cosa que és important en les proves de genòmica.
Hora de publicació: 25-nov-2022