Tot i que en teoria, una molècula de la plantilla seria suficient, normalment s'utilitzen quantitats considerablement més grans d'ADN per a una PCR clàssica, per exemple, fins a 1 µg d'ADN genòmic de mamífers i tan sols 1 pg d'ADN plasmidi. La quantitat òptima depèn en gran mesura del nombre de còpies de la seqüència objectiu, així com de la seva complexitat.
Si s'utilitza molt poca plantilla, caldrà un augment corresponent en el nombre de cicles d'amplificació per obtenir una quantitat suficient de producte. Una polimerasa Taq que s'utilitza per a la majoria d'experiments de PCR no té una funció de correcció (activitat exonucleasa 3′-5′); per tant, els errors que es produeixen durant l'amplificació no es poden corregir. Com més gran sigui el nombre de cicles, més freqüent serà l'amplificació del producte defectuós. Si, d'altra banda, la quantitat de plantilla és massa alta, augmentarà la probabilitat que els cebadors s'anexin a altres seqüències (no cent per cent complementàries), així com la formació de dímers d'imprimació, augmentarà, la qual cosa donarà lloc a l'amplificació de subproductes. En molts casos, l'ADN s'aïlla de cultius cel·lulars o de microorganismes i s'utilitza posteriorment com a plantilla de PCR. Després de la purificació, cal determinar la concentració de l'ADN per poder definir el volum que es requereix per a la configuració de la PCR. Tot i que l'electroforesi en gel d'agarosa pot servir per proporcionar una estimació, aquest mètode està lluny de ser precís. L'espectrofotometria UV-Vis s'ha establert com l'estàndard d'or per a la quantificació d'àcids nucleics; aquest mètode directe i, per tant, fàcil i ràpid mesura l'absorbància de la mostra a 260 nm, i la concentració es calcula amb l'ajuda d'un factor de conversió.
Tanmateix, si la concentració d'ADN és molt baixa (< 1 µg/mL dsDNA), o si està contaminat amb substàncies que també absorbeixen en el rang de 260 nm (per exemple, ARN, proteïnes, sals), aquest mètode arribarà a les seves limitacions. En el cas de concentracions molt baixes, les lectures aviat seran massa inexactes per ser útils i les contaminacions conduiran a una sobreestimació (de vegades enorme) del valor real. En aquest cas, la quantificació mitjançant fluorescència pot presentar una alternativa. Aquesta tècnica es basa en l'ús d'un colorant fluorescent que s'uneix específicament al dsDNA només el complex que consta d'àcid nucleic i colorant és excitat per la llum i, posteriorment, emetrà llum d'una longitud d'ona lleugerament superior. Aquí, la intensitat del senyal fluorescent és proporcional a la quantitat d'ADN, i per determinar la concentració s'avalua en relació a una corba estàndard. Els avantatges d'aquest mètode es basen en l'especificitat de l'enllaç, que exclou les influències externes introduïdes per la contaminació, així com en la capacitat resultant de detectar concentracions molt baixes d'ADN. La idoneïtat de qualsevol mètode depèn principalment de la concentració i la puresa de la mostra; en molts casos fins i tot pot ser aconsellable aplicar els dos mètodes en paral·lel.
Hora de publicació: 30-nov-2022