Za uspješne reakcije amplifikacije, neophodno je da pojedinačne komponente reakcije budu prisutne u ispravnoj koncentraciji u svakom preparatu. Osim toga, važno je da ne dođe do kontaminacije.
Naročito kada je potrebno podesiti mnoge reakcije, ustanovljeno je da se priprema takozvana glavna mješavina umjesto pipetiranja svakog reagensa zasebno u svaku posudu. Unaprijed konfigurirane mješavine su komercijalno dostupne, u koje se dodaju samo komponente specifične za uzorak (prajmer) i voda. Alternativno, master mix možete pripremiti sami. U obje varijante, smjesa se distribuira u svaku PCR posudu bez šablona, a pojedinačni uzorak DNK se dodaje posebno na kraju.
Upotreba glavne mješavine ima nekoliko prednosti: Prvo, smanjuje se broj pojedinačnih koraka pipetiranja. Na ovaj način se minimizira i rizik od grešaka korisnika tokom pipetiranja i rizik od kontaminacije i, naravno, štedi vrijeme. U principu je i tačnost pipetiranja veća, jer se doziraju veće količine. Ovo je lako razumjeti kada se provjeravaju tehnički podaci pipeta: Što je dozirana zapremina manja, odstupanja mogu biti veća. Činjenica da svi preparati dolaze iz iste posude pozitivno utiče na homogenost (ako se dobro izmešaju). Ovo također poboljšava ponovljivost eksperimenata.
Prilikom pripreme master mješavine treba dodati najmanje 10% dodatnog volumena (npr. ako je potrebno 10 priprema, izračunajte na osnovu 11), tako da se i zadnja posuda pravilno napuni. Na ovaj način se mogu kompenzirati (male) nepreciznosti pipetiranja i efekat gubitka uzorka pri doziranju otopina koje sadrže deterdžente. Deterdženti se nalaze u otopinama enzima kao što su polimeraze i master mješavine, uzrokujući stvaranje pjene i ostatke na unutrašnjoj površini normalnogvrhovi za pipete.
Ovisno o primjeni i vrsti tekućine koja se dozira, treba odabrati ispravnu tehniku pipetiranja (1) i odabrati odgovarajuću opremu. Za rastvore koji sadrže deterdžente, preporučuje se sistem direktnog pomeranja ili takozvani vrhovi pipeta sa „malim zadržavanjem“ kao alternativa za pipete sa vazdušnim jastukom. Efekat odACE PIPETTE vrhtemelji se na posebno hidrofobnoj površini. Tečnosti koje sadrže deterdžente ne ostavljaju film ostataka iznutra i izvana, tako da se gubitak rastvora može svesti na minimum.
Osim tačnog doziranja svih komponenti, važno je i da ne dođe do kontaminacije preparata. Nije dovoljno koristiti potrošni materijal visoke čistoće, jer proces pipetiranja u pipeti sa zračnim jastukom može proizvesti aerosole koji ostaju u pipeti. DNK koja može biti sadržana u aerosolu može se prenijeti s jednog uzorka na drugi u sljedećem koraku pipetiranja i tako dovesti do kontaminacije. Gore navedeni sistemi direktnog pomjeranja također mogu minimizirati ovaj rizik. Za pipete sa zračnim jastukom ima smisla koristiti vrhove filtera za zaštitu konusa pipete zadržavanjem prskanja, aerosola i biomolekula.
Vrijeme objave: Dec-06-2022