Cryovialsse obično koriste za kriogeno skladištenje ćelijskih linija i drugih kritičnih bioloških materijala, u Dewarovim posudama napunjenim tečnim dušikom.

Postoji nekoliko faza koje su uključene u uspješno očuvanje ćelija u tekućem dušiku. Dok je osnovni princip sporo zamrzavanje, tačna tehnika koja se koristi ovisi o tipu ćelije i korištenom krioprotektantu. Postoji nekoliko sigurnosnih razmatranja i najboljih praksi koje treba uzeti u obzir prilikom skladištenja ćelija na tako niskim temperaturama.

Ovaj post ima za cilj dati pregled kako se kriooviale pohranjuju u tekućem dušiku.

Šta su Cryovials

Krioviole su male bočice sa poklopcem dizajnirane za čuvanje tečnih uzoraka na ekstremno niskim temperaturama. Oni osiguravaju da ćelije sačuvane u krioprotektantu ne dođu u direktan kontakt sa tečnim azotom, minimizirajući rizik od lomova ćelija, dok i dalje imaju koristi od ekstremnog efekta hlađenja tečnog azota.

Bočice su obično dostupne u rasponu volumena i dizajna – mogu biti s unutarnjim ili vanjskim navojem s ravnim ili zaobljenim dnom. Dostupni su i sterilni i nesterilni formati.

Ko koristiCyrovialsza skladištenje ćelija u tekućem dušiku

Niz NHS i privatnih laboratorija, kao i istraživačkih institucija specijaliziranih za bankarstvo krvi pupčane vrpce, biologiju epitelnih ćelija, imunologiju i biologiju matičnih ćelija koriste kriopijale za krioprezervaciju ćelija.

Ovako sačuvane ćelije uključuju B i T ćelije, CHO ćelije, hematopoetske matične i progenitorne ćelije, hibridome, crevne ćelije, makrofage, mezenhimalne matične i progenitorne ćelije, monocite, mijelom, NK ćelije i pluripotentne matične ćelije.

Pregled kako čuvati kriopijale u tekućem dušiku

Krioprezervacija je proces koji čuva ćelije i druge biološke konstrukcije hlađenjem na vrlo niske temperature. Ćelije se mogu skladištiti u tekućem dušiku godinama bez gubitka vitalnosti ćelije. Ovo je pregled primijenjenih procedura.

Cell Preparation

Tačna metoda za pripremu uzoraka će varirati ovisno o tipu ćelije, ali općenito, ćelije se sakupljaju i centrifugiraju kako bi se razvila peleta bogata ćelijama. Ova kuglica se zatim resuspendira u supernatantu pomiješanom sa krioprotektorom ili medijumom za krioprezervaciju.

Cryopreservation Medium

Ovaj medij se koristi za očuvanje ćelija u okruženjima niskih temperatura kojima će biti izloženi inhibiranjem formiranja intra i ekstracelularnih kristala i stoga ćelijske smrti. Njihova uloga je da obezbede sigurno, zaštitno okruženje za ćelije i tkiva tokom procesa zamrzavanja, skladištenja i odmrzavanja.

Medij kao što je svježe smrznuta plazma (FFP), otopina hepariniziranog plazmalita ili otopine bez seruma, bez životinjskih komponenti, miješa se sa krioprotektantima kao što je dimetil sulfoksid (DMSO) ili glicerol.

Peleta ponovnog tečnog uzorka je alikvotna u polipropilenske krio-ovioke kao nprBiomedicinska kompanija Suzhou Ace Cryogenic Storage Vials.

Važno je ne prepuniti posude za kriopijale jer će to povećati rizik od pucanja i mogućeg oslobađanja sadržaja (1).

Kontrolisana stopa zamrzavanja

Općenito, za uspješno krioprezervaciju ćelija koristi se spora kontrolisana brzina zamrzavanja.

Nakon što se uzorci alikvotiraju u kriogene bočice, stavljaju se na mokri led ili u frižider na 4℃ i postupak zamrzavanja počinje u roku od 5 minuta. Kao opšti vodič, ćelije se hlade brzinom od -1 do -3 u minuti (2). Ovo se postiže korišćenjem programabilnog hladnjaka ili stavljanjem bočica u izolovanu kutiju smeštenu u zamrzivač sa kontrolisanom brzinom od –70°C do –90°C.

Prebacite u tečni azot

Zamrznute kriogene bočice se zatim prenose u rezervoar sa tečnim azotom na neodređeno vreme pod uslovom da se održava temperatura niža od -135℃.

Ove ultra niske temperature mogu se postići uranjanjem u tečnu ili paru fazu azota.

Tečna ili parna faza?

Poznato je da skladištenje azota u tečnoj fazi održava hladnu temperaturu sa apsolutnom konzistencijom, ali se često ne preporučuje iz sledećih razloga:

• Potreba za velikim količinama (dubinom) tekućeg dušika što predstavlja potencijalnu opasnost. Opekline ili gušenje zbog toga predstavljaju pravi rizik.
• Dokumentirani slučajevi unakrsne kontaminacije infektivnim agensima kao što su aspergillus, hep B i širenje virusa putem medija s tekućim dušikom (2,3)
• Mogućnost curenja tečnog azota u bočice tokom potapanja. Kada se izvadi iz skladišta i zagrije na sobnu temperaturu, dušik se brzo širi. Shodno tome, bočica se može razbiti kada se izvadi iz skladišta tečnog azota, stvarajući opasnost i od letećih krhotina i od izlaganja sadržaju (1, 4).

Iz ovih razloga, skladištenje na ultra niskim temperaturama najčešće je u azotu u parnoj fazi. Kada se uzorci moraju čuvati u tečnoj fazi, treba koristiti specijalizovane cryoflex cijevi.

Nedostatak parne faze je što može doći do vertikalnog temperaturnog gradijenta koji rezultira temperaturnim fluktuacijama između -135 ℃ i -190 ℃. To zahtijeva pažljivo i marljivo praćenje nivoa tečnog azota i temperaturnih varijacija (5).

Mnogi proizvođači preporučuju da su kriooviale prikladne za skladištenje do -135 ℃ ili samo za upotrebu u parnoj fazi.

Odmrzavanje vaših kriokonzerviranih ćelija

Postupak odmrzavanja je stresan za zamrznutu kulturu, a potrebno je pravilno rukovanje i tehnika kako bi se osigurala optimalna održivost, oporavak i funkcionalnost ćelija. Tačni protokoli odmrzavanja ovisit će o specifičnim tipovima ćelija. Međutim, brzo odmrzavanje se smatra standardnim za:

• Smanjite bilo kakav uticaj na ćelijski oporavak
• Pomozite da se smanji vrijeme izlaganja otopljenim tvarima prisutnim u mediju za zamrzavanje
• Minimizirajte bilo kakvu štetu rekristalizacijom leda

Za odmrzavanje uzoraka obično se koriste vodene kupke, kupke s perlama ili specijalizirani automatizirani instrumenti.

Najčešće se po 1 ćelijska linija odmrzava 1-2 minute, laganim vrtložnim miješanjem u vodenom kupatilu na 37 ℃ sve dok u bočici ne ostane samo malo leda prije nego što se isperu u prethodno zagrijanom mediju za rast.

Za neke ćelije, kao što su embrioni sisara, sporo zagrevanje je neophodno za njihov opstanak.

Ćelije su sada spremne za ćelijsku kulturu, ćelijsku izolaciju, ili u slučaju hematopoetskih matičnih ćelija – studije održivosti kako bi se jamčio integritet matičnih ćelija donora prije mijeloablativne terapije.

Normalna je praksa da se uzimaju mali alikvoti prethodno opranog uzorka koji se koriste za prebrojavanje ćelija da bi se odredile koncentracije ćelija za postavljanje u kulturu. Zatim možete procijeniti rezultate postupaka izolacije ćelija i odrediti vitalnost ćelije.

Najbolje prakse za skladištenje kriopijala

Uspješno krioprezervacija uzoraka pohranjenih u krio-oviokama ovisi o mnogim elementima u protokolu uključujući pravilno skladištenje i vođenje evidencije.

• Podijelite ćelije između lokacija za pohranu– Ako zapremine dozvoljavaju, podijelite ćelije između bočica i pohranite ih na odvojene lokacije kako biste smanjili rizik od gubitka uzorka zbog kvarova opreme.
• Spriječiti unakrsnu kontaminaciju– Odlučite se za sterilne kriogene bočice za jednokratnu upotrebu ili autoklav prije sljedeće upotrebe
• Koristite bočice odgovarajuće veličine za vaše ćelije– bočice dolaze u rasponu volumena između 1 i 5 ml. Izbjegavajte prepunjavanje bočica kako biste smanjili rizik od pucanja.
• Odaberite kriogene bočice s unutrašnjim ili vanjskim navojem– Neki univerziteti preporučuju bočice sa unutrašnjim navojem za mere bezbednosti – one takođe mogu da spreče kontaminaciju tokom punjenja ili kada se čuvaju u tečnom azotu.
• Sprečiti curenje- Koristite bi-injektirane zaptivke utisnute u poklopac sa navojem ili O-prstenove kako biste spriječili curenje i kontaminaciju.
• Koristite 2D barkodove i bočice sa etiketama– kako bi se osigurala sljedivost, bočice s velikim površinama za pisanje omogućavaju da svaka bočica bude adekvatno označena. 2D bar kodovi mogu pomoći u upravljanju skladištenjem i vođenju zapisa. Kape označene bojama su korisne za lakšu identifikaciju.
• Adekvatno održavanje skladištenja- Da bi se osiguralo da se ćelije ne izgube, posude za skladištenje treba da stalno prate temperaturu i nivoe tečnog azota. Alarmi bi trebali biti postavljeni da upozoravaju korisnike na greške.

Sigurnosne mjere

Tečni dušik je postao uobičajena praksa u modernim istraživanjima, ali nosi rizik od ozbiljnih ozljeda ako se koristi nepravilno.

Treba nositi odgovarajuću ličnu zaštitnu opremu (PPE) kako bi se smanjio rizik od promrzlina, opekotina i drugih štetnih incidenata pri rukovanju tečnim dušikom. Nosite

• Kriogene rukavice
• Laboratorijski kaput
• Štitnik za cijelo lice otporan na udarce koji također pokriva vrat
• Cipele sa zatvorenim prstima
• Plastična pregača otporna na prskanje

Frižidere sa tečnim azotom treba postaviti u dobro provetrene prostore kako bi se smanjio rizik od gušenja – azot koji je izašao isparava i istiskuje atmosferski kiseonik. Prodavnice velikih količina treba da imaju alarmne sisteme za nizak nivo kiseonika.

Rad u paru pri rukovanju tečnim azotom je idealan i njegovu upotrebu van uobičajenog radnog vremena treba zabraniti.

Cryovials za podršku vašem toku rada

Kompanija Suzhou Ace Biomedical nudi širok izbor proizvoda koji zadovoljavaju vaše potrebe za krioprezervacijom za različite tipove ćelija. Portfolio uključuje niz epruveta, kao i niz sterilnih krio-ovia.

Naši krioovi su:

• Lab čep na navoj 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kriovijalne kriogene bočice sa konusnim dnom kriocev sa zaptivkom

  ● 0.5ml,1.5ml,2.0ml specifikacija, sa suknjom ili bez suknje
  ● Dostupni su konusni ili samostojeći dizajn, sterilni ili nesterilni
  ● Cijevi s navojnim poklopcem su napravljene od medicinskog polipropilena
  ● PP bočice za kriotube mogu se više puta zamrznuti i odmrznuti
  ● Dizajn spoljne kapice može smanjiti verovatnoću kontaminacije tokom tretmana uzorka.
  ● Kriogene cijevi s poklopcem Univerzalni navoji za upotrebu
  ● Cijevi odgovaraju većini uobičajenih rotora
  ● O-ring cijevi za kriogene cijevi odgovaraju standardnim kutijama zamrzivača od 1 inča i 2 inča, 48 jažica, 81 jažica, 96 i 100 jažica
  ● Može se autoklavirati na 121°C i zamrzavati do -86°C

  DEO BR	MATERIJAL	VOLUME	CAPCOLOR	PCS/BAG	TORBE/KUSIJA
  ACT05-BL-N	PP	0.5ML	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5ML	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5ML	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10