Standardizacija procesa uključuje njihovu optimizaciju i naknadno uspostavljanje i usklađivanje, omogućavajući dugoročne optimalne performanse – nezavisno od korisnika. Standardizacija osigurava rezultate visokog kvaliteta, kao i njihovu ponovljivost i uporedivost.
Cilj (klasičnog) PCR-a je stvaranje pouzdanog i ponovljivog rezultata. Za određene primjene, prinos odPCR proizvodje takođe relevantno. Za ove reakcije, mora se voditi računa da uzorci nisu ugroženi i da PCR radni tok ostane stabilan. Konkretno, ovo se prevodi na minimiziranje unošenja kontaminacija koje bi mogle dovesti do lažno pozitivnih ili lažno negativnih rezultata ili čak inhibirati PCR reakciju. Nadalje, uvjeti reakcije trebaju biti što je moguće identični za svaki pojedinačni uzorak unutar serije i također se mogu prenijeti na sljedeće reakcije (iste metode). Ovo se odnosi na sastav reakcija kao i na tip kontrole temperature u ciklusu. Korisničke greške, naravno, treba izbjegavati koliko god je to moguće.
U nastavku ćemo demonstrirati izazove sa kojima se susreću tokom pripreme i tokom trajanja PCR-a – i pristupe rješenjima koji postoje u pogledu instrumenata i potrošnog materijala koji se koriste za standardizaciju tokova PCR-a.
Priprema reakcije
Doziranje reakcionih komponenti u PCR posude, odnosno ploče, uključuje više izazova koji se moraju savladati:
Uslovi reakcije
Tačno i precizno doziranje pojedinačnih komponenti je neophodno kada se ciljaju na najidentičnije moguće uslove reakcije. Osim dobre tehnike pipetiranja, odabir pravog alata je ključan. PCR master-miksevi često sadrže supstance koje povećavaju viskozitet ili stvaraju penu. Tokom procesa pipetiranja, oni dovode do značajnog vlaženjavrhovi za pipete, čime se smanjuje preciznost pipetiranja. Upotreba sistema za direktno doziranje ili alternativnih vrhova pipeta koji su manje skloni vlaženju može poboljšati tačnost i preciznost procesa pipetiranja.
Kontaminacije
Tokom procesa doziranja, stvaraju se aerosoli koji, ako im se dozvoli da dođu u unutrašnjost pipete, mogu potencijalno kontaminirati drugi uzorak tokom sljedećeg koraka pipetiranja. Ovo se može spriječiti korištenjem vrhova filtera ili sistema direktnog pomjeranja.
Potrošni materijal kao nprsavjeti, posude i ploče koje se koriste u PCR radnom toku ne smiju sadržavati tvari koje kompromituju uzorak ili krivotvore rezultat. To uključuje DNK, DNaze, RNaze i PCR inhibitore, kao i komponente koje se potencijalno mogu ispirati iz materijala tokom reakcije – supstance poznate kao izluživače.
Korisnička greška
Što se više uzoraka obradi, veći je rizik od greške. Lako se može dogoditi da se uzorak pipetira u pogrešnu posudu ili u pogrešnu bunar. Ovaj rizik se može značajno smanjiti lako uočljivim označavanjem bunara. Kroz automatizaciju koraka doziranja, „ljudski faktor“, odnosno greške i varijacije vezane za korisnika, minimizirani su, čime se povećava ponovljivost, posebno u slučaju malih reakcijskih volumena. Ovo zahtijeva ploče dovoljne dimenzionalne stabilnosti da bi se koristile u radnoj stanici. Priloženi bar kodovi pružaju dodatnu mašinsku čitljivost, što pojednostavljuje praćenje uzorka tokom cijelog procesa.
Programiranje termociklera
Programiranje instrumenta može se pokazati kao dugotrajno i podložno greškama. Različite karakteristike PCR termalnog ciklusa rade zajedno da pojednostave ovaj korak procesa i, što je najvažnije, da ga učine sigurnim:
Jednostavan rad i dobro navođenje korisnika su osnova efikasnog programiranja. Nadovezujući se na ovu osnovu, administracija korisnika zaštićena lozinkom će spriječiti da drugi korisnici mijenjaju vlastite programe. Ako se koristi više ciklusa (istog tipa), korisno je ako se program može direktno prenijeti s jednog instrumenta na drugi putem USB-a ili veze. Računarski softver omogućava centralnu i sigurnu administraciju programa, korisničkih prava i dokumenata na računaru.
PCR run
Tokom rada, DNK se umnožava u reakcionoj posudi, gde svaki uzorak treba da bude podvrgnut identičnim, konzistentnim reakcionim uslovima. Za proces su relevantni sljedeći aspekti:
Kontrola temperature
Odlična preciznost u kontroli temperature i homogenost ciklusnog bloka su osnova za ravnomjerno temperaturno kondicioniranje svih uzoraka. Visok kvalitet grijaćih i rashladnih elemenata (peltierovih elemenata), kao i način na koji su spojeni na blok, odlučujući su faktori koji će odrediti rizik od temperaturnih odstupanja poznatih kao „efekat ruba“
Isparavanje
Koncentracije pojedinačnih komponenti reakcije ne bi se trebale mijenjati tokom reakcije zbog isparavanja. Inače, moguće je da vrlo maloPCR proizvodmože biti generisana ili uopšte nijedna. Stoga je ključno minimizirati isparavanje osiguravanjem sigurnog brtvljenja. U ovom slučaju, grijani poklopac termociklera i brtva posude rade ruku pod ruku. Dostupne su različite opcije zaptivanjaPCR ploče (link: Zaptivni članak), pri čemu se najbolje zaptivanje postiže termičkim zavarivanjem. Mogu biti prikladni i drugi zatvarači, sve dok se kontaktni pritisak poklopca ciklera može podesiti na odabranu zaptivku.
Uspostavljena je standardizacija procesa kako bi se osigurali tačni i ponovljivi rezultati na dugi rok. To uključuje redovno održavanje opreme kako bi se osiguralo da je uvijek u dobrom radnom stanju. Sav potrošni materijal treba da bude konstantno visokog kvaliteta u svim proizvedenim serijama, a njihova pouzdana dostupnost mora biti zagarantovana.
Vrijeme objave: 29.11.2022