Ekstrakcija nukleinske kiseline i metoda magnetne kuglice

Uvod

Šta je ekstrakcija nukleinske kiseline?

Najjednostavnije rečeno, ekstrakcija nukleinske kiseline je uklanjanje RNK i/ili DNK iz uzorka i svega viška koji nije potreban. Proces ekstrakcije izoluje nukleinske kiseline iz uzorka i daje ih u obliku koncentriranog eluata, bez razblaživača i kontaminanata koji bi mogli uticati na bilo koju daljnju primjenu.

Primjena ekstrakcije nukleinskih kiselina

Pročišćene nukleinske kiseline koriste se u mnoštvu različitih primjena, u rasponu od više različitih industrija. Zdravstvo je možda područje u kojem se najviše koristi, s pročišćenom RNK i DNK potrebnim za mnoštvo različitih svrha testiranja.

Primjene ekstrakcije nukleinske kiseline u zdravstvu uključuju:

- PCR i qPCR amplifikacija

- Sljedeća generacija sekvenciranja (NGS)

- SNP genotipizacija zasnovana na amplifikaciji

- Genotipizacija zasnovana na nizu

- Probava restrikcijskim enzimima

- Analize korištenjem modificirajućih enzima (npr. ligacija i kloniranje)

Postoje i druga polja izvan zdravstva u kojima se koristi ekstrakcija nukleinske kiseline, uključujući, ali ne ograničavajući se na testiranje očinstva, forenziku i genomiku.

Kratka istorija ekstrakcije nukleinske kiseline

Ekstrakcija DNKdatira u daleku prošlost, a prvu poznatu izolaciju izvršio je švajcarski lekar po imenu Fridrih Mišer 1869. Mišer se nadao da će rešiti osnovne principe života određivanjem hemijskog sastava ćelija. Nakon neuspjeha s limfocitima, uspio je dobiti sirovi precipitat DNK iz leukocita pronađenih u gnoju na odbačenim zavojima. On je to učinio dodavanjem kiseline, a zatim alkalije u ćeliju da napusti ćelijsku citoplazmu, a zatim je razvio protokol za odvajanje DNK od ostalih proteina.

Nakon Miescherovog revolucionarnog istraživanja, mnogi drugi naučnici su nastavili da unapređuju i razvijaju tehnike za izolaciju i pročišćavanje DNK. Edwin Joseph Cohn, znanstvenik za proteine, razvio je mnoge tehnike za pročišćavanje proteina tokom Drugog svjetskog rata. Bio je odgovoran za izolaciju frakcije serumskog albumina iz krvne plazme, koja je važna za održavanje osmotskog tlaka u krvnim žilama. Ovo je bilo ključno za održavanje vojnika u životu.

Godine 1953. Francis Crick, zajedno s Rosalind Franklin i James Watsonom, utvrdio je strukturu DNK, pokazujući da se sastoji od dva lanca dugih lanaca nukleotida nukleinske kiseline. Ovo revolucionarno otkriće otvorilo je put Meselsonu i Stahlu, koji su mogli razviti protokol centrifugiranja s gradijentom gustine za izolaciju DNK iz bakterije E. Coli dok su demonstrirali polukonzervativnu replikaciju DNK tokom svog eksperimenta 1958. godine.

Tehnike ekstrakcije nukleinske kiseline

Koje su 4 faze ekstrakcije DNK?
Sve metode ekstrakcije se svode na iste osnovne korake.

Cell Disruption. Ova faza, također poznata kao ćelijska liza, uključuje razbijanje ćelijskog zida i/ili ćelijske membrane, kako bi se oslobodile unutarćelijske tekućine koje sadrže nukleinske kiseline od interesa.

Uklanjanje neželjenih ostataka. Ovo uključuje membranske lipide, proteine ​​i druge neželjene nukleinske kiseline koje mogu ometati daljnje primjene.

Izolacija. Postoji nekoliko različitih načina za izolaciju nukleinskih kiselina od interesa iz očišćenog lizata koji ste stvorili, a koji spadaju u dvije glavne kategorije: na bazi otopine ili u čvrstom stanju (pogledajte sljedeći odjeljak).

Koncentracija. Nakon što su nukleinske kiseline izolovane od svih ostalih zagađivača i razblaživača, daju se u visokokoncentrirani eluat.

Dvije vrste ekstrakcije
Postoje dvije vrste ekstrakcije nukleinske kiseline – metode zasnovane na rastvoru i metode u čvrstom stanju. Metoda zasnovana na rastvoru poznata je i kao metoda hemijske ekstrakcije, jer uključuje upotrebu hemikalija za razgradnju ćelije i pristup nukleinskom materijalu. To može biti korištenje ili organskih spojeva kao što su fenol i kloroform, ili manje štetnih i stoga više preporučenih neorganskih spojeva kao što su proteinaza K ili silika gel.

Primjeri različitih metoda kemijske ekstrakcije za razgradnju ćelije uključuju:

- Osmotska ruptura membrane

- Enzimska probava ćelijskog zida

- Solubilizacija membrane

- Sa deterdžentima

- Sa alkalnim tretmanom

Tehnike čvrstog stanja, poznate i kao mehaničke metode, uključuju iskorištavanje načina na koji DNK stupa u interakciju sa čvrstim supstratom. Odabirom kuglice ili molekule na koju će se DNK vezati, ali analit neće, moguće je razdvojiti to dvoje. Primjeri tehnika ekstrakcije u čvrstoj fazi uključujući korištenje silicijum dioksida i magnetnih perli.

Objašnjeno vađenje magnetnih perli

Metoda ekstrakcije magnetnih perli
Potencijal za ekstrakciju pomoću magnetnih perli prvi put je prepoznat u američkom patentu koji je prijavio Trevor Hawkins za istraživačku instituciju Instituta Whitehead. Ovaj patent je priznao da je moguće ekstrahovati genetski materijal vezivanjem na čvrsti nosač, koji bi mogao biti magnetna zrna. Princip je da koristite visoko funkcionaliziranu magnetnu kuglicu na koju će se vezati genetski materijal, koji se zatim može odvojiti od supernatanta primjenom magnetske sile na vanjsku stranu posude koja drži uzorak.

Zašto koristiti ekstrakciju magnetnih perli?
Tehnologija ekstrakcije magnetnih kuglica postaje sve zastupljenija, zbog potencijala koji ima za brze i efikasne postupke ekstrakcije. U novije vrijeme došlo je do razvoja visoko funkcionaliziranih magnetnih kuglica s odgovarajućim puferskim sistemima, koji su omogućili automatizaciju ekstrakcije nukleinske kiseline i radni tok koji je vrlo lagan i ekonomičan. Također, metode ekstrakcije magnetnih kuglica ne uključuju korake centrifugiranja koji mogu uzrokovati posmične sile koje razbijaju duže dijelove DNK. To znači da duži lanci DNK ostaju netaknuti, što je važno u genomskom testiranju.