Koliko šablona treba da dodamo mojoj PCR reakciji?

Iako bi u teoriji jedan molekul šablona bio dovoljan, za klasični PCR se obično koriste znatno veće količine DNK, na primjer, do 1 µg genomske DNK sisara i samo 1 pg plazmidne DNK. Optimalna količina u velikoj mjeri zavisi od broja kopija ciljne sekvence, kao i od njene složenosti.

Ako se koristi vrlo malo šablona, ​​biće potrebno odgovarajuće povećanje broja ciklusa amplifikacije da bi se dobila dovoljna količina proizvoda. Taq polimeraza koja se koristi za većinu PCR eksperimenata nema funkciju korekcije (aktivnost 3′-5′ egzonukleaze); stoga se greške koje se javljaju tokom pojačanja ne mogu ispraviti. Što je veći broj ciklusa, to će više preovladavati pojačanje proizvoda s nedostatkom. Ako je, s druge strane, količina šablona previsoka, povećava se vjerovatnoća da će se prajmeri spojiti na druge (ne stopostotno komplementarne) sekvence, kao i formiranje dimera prajmera, što će rezultirati amplifikacijom prajmera. nusproizvodi. U mnogim slučajevima, DNK se izoluje iz ćelijskih kultura ili iz mikroorganizama i zatim se koristi kao PCR šablon. Nakon pročišćavanja, potrebno je odrediti koncentraciju DNK da bi se mogao definirati volumen koji je potreban za PCR postavku. Dok elektroforeza u agaroznom gelu može poslužiti za pružanje procjene, ova metoda je daleko od tačne. UV-Vis spektrofotometrija je ustanovljena kao zlatni standard za kvantifikaciju nukleinskih kiselina; ova direktna i stoga laka i brza metoda mjeri apsorpciju uzorka na 260 nm, a koncentracija se izračunava uz pomoć faktora konverzije.

Međutim, ako je koncentracija DNK vrlo niska (< 1 µg/mL dsDNA), ili ako je kontaminirana supstancama koje također apsorbiraju u rasponu od 260 nm (npr. RNK, proteini, soli), ova metoda će dostići svoja ograničenja. U slučaju vrlo niskih koncentracija, očitavanja će uskoro postati previše neprecizna da bi bila od koristi, a kontaminacije će dovesti do (ponekad enormnog) precjenjivanja stvarne vrijednosti. U ovom slučaju, kvantifikacija pomoću fluorescencije može predstavljati alternativu. Ova tehnika se zasniva na upotrebi fluorescentne boje koja se specifično vezuje za dsDNK, samo kompleks koji sadrži nukleinsku kiselinu i boju pobuđuje svetlost, a zatim će emitovati svetlost nešto veće talasne dužine. Ovdje je intenzitet fluorescentnog signala proporcionalan količini DNK, a za određivanje koncentracije se procjenjuje u odnosu na standardnu ​​krivu. Prednosti ove metode počivaju na specifičnosti veze, koja isključuje vanjske utjecaje unesene kontaminacijom, kao i na rezultirajuću sposobnost detekcije vrlo niskih koncentracija DNK. Pogodnost bilo koje metode uglavnom ovisi o koncentraciji uzorka i čistoći; u mnogim slučajevima može čak biti preporučljivo primijeniti obje metode paralelno.


Vrijeme objave: 30.11.2022