Iako je u teoriji bilo jedna molekula predloška, znatno veće količine DNK-a obično se koriste za klasični PCR, na primjer, do 1 μg genomske sisarne DNK i samo 1 pg plazmid DNK. Optimalni iznos u velikoj mjeri ovisi o broju primjeraka ciljanog slijeda, kao i na njenoj složenosti.
Ako se koristi vrlo mali predložak, bit će potreban odgovarajući porast broja ciklusa pojačanja za dobivanje dovoljne količine proizvoda. TAQ polimeraza koja se koristi za većinu PCR eksperimenata ne sadrži funkciju korekcije (3-5 'egzonukleizvaja); Stoga se ne mogu ispraviti pogreške tokom pojačanja. Što je veći broj ciklusa, prevladavniji pojačavanje pogrešnog proizvoda bit će. Ako je s druge strane, količina predloška previsoka, povećaće se vjerojatnost prajmera na drugu (ne sto posto besplatne) sekvence, kao i formiranje bagera temeljnih dimera, što će rezultirati pojačanjem nusproizvodi. U mnogim se slučajevima DNK izolira od ćelijskih kultura ili iz mikroorganizama i naknadno se koristi kao PCR predložak. Nakon pročišćavanja potrebno je odrediti koncentraciju DNK kako bi se mogla definirati volumen koji je potreban za PCR postavku. Dok elektroforeza agaroze može poslužiti za pružanje procjene, ova metoda je daleko od preciznog. UV-Vis spektrofotometrija uspostavljena je kao zlatni standard za kvantifikaciju nukleinskih kiselina; Ovo direktno i zato su jednostavne i brze metode upijaju uzorak uzorak na 260 Nm, a koncentracija se izračunava uz pomoć faktora konverzije.
Ako je koncentracija DNK vrlo niska (<1 μg / ml dsdna) ili ako je kontaminirana tvarima koja takođe apsorbiraju u rasponu od 260 Nm (npr. RNA, proteina, soli), ova metoda će dostići njegovu ograničenja. U slučaju vrlo niskih koncentracija, čitanja će uskoro postati previše netačna da bi bila od koristi, a kontaminacije će dovesti do (ponekad ogromne) precjenjenosti stvarne vrijednosti. U ovom slučaju kvantifikacija korištenjem fluorescencije može predstavljati alternativu. Ova se tehnika temelji na korištenju fluorescentne boje koja se posebno veže na DSDNA samo kompleks koji sadrži nukleinsku kiselinu i boju uzbuđuju se svjetlom, a naknadno će emitirati svjetlost malo veće talasne dužine. Ovdje je intenzitet fluorescentnog signala proporcionalan količini DNK-a i za određivanje koncentracije procjenjuje se u odnosu na standardnu krivulju. Prednosti ove metode počivaju na specifičnosti veze, što isključuje vanjske utjecaje uvedene kontaminacijom, kao i na rezultirajuću sposobnost otkrivanja vrlo niskih koncentracija DNK. Pogodnost bilo koje metode uglavnom ovisi o koncentraciji i čistoći uzorka; U mnogim slučajevima može čak biti preporučljivo primijeniti i metode paralelno.
Vrijeme pošte: Nov-30-2022