আমার পিসিআর প্রতিক্রিয়াতে আমাদের কত টেমপ্লেট যুক্ত করা উচিত?

যদিও তাত্ত্বিকভাবে, টেমপ্লেটের একটি অণু যথেষ্ট হবে, যথেষ্ট পরিমাণে ডিএনএ সাধারণত একটি ক্লাসিক পিসিআর-এর জন্য ব্যবহৃত হয়, উদাহরণস্বরূপ, জিনোমিক স্তন্যপায়ী ডিএনএ 1 µg পর্যন্ত এবং প্লাজমিড ডিএনএর 1 পিজি পর্যন্ত। সর্বোত্তম পরিমাণ মূলত টার্গেট সিকোয়েন্সের কপির সংখ্যা এবং সেইসাথে এর জটিলতার উপর নির্ভর করে।

যদি খুব কম টেমপ্লেট ব্যবহার করা হয়, পর্যাপ্ত পরিমাণে পণ্য পাওয়ার জন্য পরিবর্ধন চক্রের সংখ্যার একটি অনুরূপ বৃদ্ধির প্রয়োজন হবে। একটি Taq পলিমারেজ যা বেশিরভাগ পিসিআর পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত হয় একটি সংশোধন ফাংশন বৈশিষ্ট্যযুক্ত নয় (3′-5′ exonuclease কার্যকলাপ); সুতরাং, পরিবর্ধনের সময় ঘটে যাওয়া ত্রুটিগুলি সংশোধন করা যায় না। চক্রের সংখ্যা যত বেশি হবে, ত্রুটিযুক্ত পণ্যের পরিবর্ধন তত বেশি হবে। অন্য দিকে, যদি টেমপ্লেটের পরিমাণ খুব বেশি হয়, তাহলে প্রাইমারগুলি অন্যান্য (একশত শতাংশ কমপ্লিমেন্টারি নয়) সিকোয়েন্সে অ্যানিলিং করার সম্ভাবনা, সেইসাথে প্রাইমার ডাইমারগুলির গঠন বৃদ্ধি পাবে, যার ফলে প্রসারিত হবে উপ-পণ্য অনেক ক্ষেত্রে, ডিএনএ কোষের সংস্কৃতি বা অণুজীব থেকে বিচ্ছিন্ন হয় এবং পরবর্তীতে পিসিআর টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়। বিশুদ্ধকরণের পরে, পিসিআর সেটআপের জন্য প্রয়োজনীয় ভলিউম সংজ্ঞায়িত করতে সক্ষম হওয়ার জন্য ডিএনএর ঘনত্ব নির্ধারণ করা প্রয়োজন। যদিও আগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস একটি অনুমান প্রদান করতে পারে, এই পদ্ধতিটি সঠিক থেকে অনেক দূরে। ইউভি-ভিস স্পেকট্রোফটোমেট্রিকে নিউক্লিক অ্যাসিডের পরিমাণ নির্ধারণের জন্য সোনার মান হিসাবে প্রতিষ্ঠিত করা হয়েছে; এই সরাসরি এবং তাই সহজ এবং দ্রুত পদ্ধতিটি 260 এনএম-এ নমুনার শোষণ পরিমাপ করে এবং একটি রূপান্তর ফ্যাক্টরের সাহায্যে ঘনত্ব গণনা করা হয়।

যদি DNA ঘনত্ব খুব কম হয়, তবে (< 1 µg/mL dsDNA), অথবা যদি এটি এমন পদার্থ দ্বারা দূষিত হয় যা 260 nm পরিসরে (যেমন RNA, প্রোটিন, লবণ) শোষণ করে, তবে এই পদ্ধতিটি তার সীমাবদ্ধতায় পৌঁছে যাবে। খুব কম ঘনত্বের ক্ষেত্রে, রিডিংগুলি খুব শীঘ্রই ব্যবহারের জন্য খুব ভুল হয়ে যাবে, এবং দূষণগুলি প্রকৃত মূল্যের (কখনও কখনও বিশাল) অত্যধিক মূল্যায়নের দিকে পরিচালিত করবে। এই ক্ষেত্রে, ফ্লুরোসেন্স ব্যবহার করে পরিমাণ নির্ধারণ একটি বিকল্প উপস্থাপন করতে পারে। এই কৌশলটি একটি ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক ব্যবহারের উপর ভিত্তি করে যা বিশেষভাবে dsDNA-র সাথে আবদ্ধ হয় শুধুমাত্র নিউক্লিক অ্যাসিড এবং রঞ্জক সমন্বিত জটিল আলো দ্বারা উত্তেজিত হয় এবং এটি পরবর্তীতে একটি সামান্য উচ্চতর তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো নির্গত করবে। এখানে, ফ্লুরোসেন্ট সংকেতের তীব্রতা ডিএনএর পরিমাণের সমানুপাতিক, এবং ঘনত্ব নির্ধারণের জন্য এটি একটি আদর্শ বক্ররেখার সাথে মূল্যায়ন করা হয়। এই পদ্ধতির সুবিধাগুলি বন্ধনের নির্দিষ্টতার উপর নির্ভর করে, যা দূষণের দ্বারা প্রবর্তিত বাহ্যিক প্রভাবগুলিকে বাদ দেয়, সেইসাথে ডিএনএর খুব কম ঘনত্ব সনাক্ত করার ফলাফলের ক্ষমতার উপর। উভয় পদ্ধতির উপযুক্ততা প্রধানত নমুনার ঘনত্ব এবং বিশুদ্ধতার উপর নির্ভর করে; অনেক ক্ষেত্রে এটি সমান্তরালভাবে উভয় পদ্ধতি প্রয়োগ করার পরামর্শ দেওয়া হতে পারে।